Jak vznikají lymfomy Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno PřF a LF MU Brno 8.9.2015, Brno XVII. Ročník kurzu genetiky a molekulární biologie pro učitele středních škol Jak vznikají lymfomy Prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc. Ústav patologie FN Brno PřF a LF MU Brno 8.9.2015, Brno XVII. Ročník kurzu genetiky a molekulární biologie pro učitele středních škol Mgr. Jana Koptíková, Ph.D. Institut biostatistiky a analýz LF MU Brno  Jak vznikají nádory  Kterými vlastnostmi se liší nádorová buňka od zdravé? • poškození regulace buněčného dělení • poškození programované buněčné smrti • získání neomezeného replikačního potenciálu • indukce angiogeneze • tvorba metastáz • navýšená genetická nestabilita  Lymfomy, lymfocyty, protilátky  Vývoj B lymfocytů  Vznik lymfomů  Závěr Jak vznikají lymfomy Osnova Jediná odrodilá buňka • Nádory vznikají porušením základních pravidel sociálního chování. • Pro organismus nepředstavuje vážné riziko, pokud se jednotlivá buňka nahodile nezachová správně. Potenciálně nebezpečná situace nastává tehdy, pokud dojde v jedné buňce ke genetické (nebo epigenetické) změně, která buňce dovolí přežít, rozdělit se a tak produkovat dceřiné buňky s podobně asociálním chováním. • Organizace tkáně nebo i celého organismu tak může být rozvrácena postupně expandujícím klonem abnormálních buněk. Nádorová buňka se vyvíjí postupným hromaděním genetických (a epigenetických) změn Vícestupňová kancerogeneze spojená s kroky klonální expanze (selekce) Onkogeny a nádorové supresory Protoonkogen je strukturní gen, jehož produkt se podílí na stimulaci dělení buněk a jejich diferenciace. Onkogen je protoonkogen aktivovaný tak, že vyvolává neoplastickou transformaci buňky.  aktivace protoonkogenu je přeměna protoonkogenu na onkogen  mutace protoonkogenů jsou aktivující, dominantní Produkty genů pro nádorové supresory (antionkogeny) v normálních buňkách nevyvolávají proliferaci, ale naopak ji potlačují a udržují buňky ve stadiu klidu.  mutace nádorových supresorů jsou inaktivující, recesivní (spojeno s inaktivací/ztrátou druhé alely)  Jak vznikají nádory  Kterými vlastnostmi se liší nádorová buňka od zdravé? • poškození regulace buněčného dělení • poškození programované buněčné smrti • získání neomezeného replikačního potenciálu • indukce angiogeneze • tvorba metastáz • navýšená genetická nestabilita  Lymfomy, lymfocyty, protilátky  Vývoj B lymfocytů  Vznik lymfomů  Závěr Jak vznikají lymfomy Osnova Sedm typických znaků nádorových buněk Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 100 (2000) 57-70 Sedm typických znaků nádorových buněk Poškození regulace buněčného dělení 1, 2 Poškození regulace buněčného dělení 1, 2 mitóza Průběh buněčného cyklu a jeho regulace mitóza Poškození regulace buněčného dělení Průběh buněčného cyklu a jeho regulace: bod restrikce bod restrikce: klíčový regulační, rozhodovací bod buněčného cyklu Regulace buněčného cyklu Jak buňky komunikují Obecná struktura signální dráhy • signální molekuly/ růstové faktory • receptory růstových faktorů • cytoplazmatické přenašeče • transkripční faktory Regulace buněčného cyklu cykliny D – protoonkoproteiny stimulující b.c. Poškození apoptózy (programované buněčné smrti) 3 • Apoptotický program je latentně přítomen ve všech buňkách. • Buňky jsou neustále připraveny odumřít apoptózou, je-li to v zájmu celého organismu. Poškození apoptózy (programované buněčné smrti) 3 • Apoptotický program je latentně přítomen ve všech buňkách. • Buňky jsou neustále připraveny odumřít apoptózou, je-li to v zájmu celého organismu. • Signály indukující apoptózu: poškození DNA, aktivace onkogenů, hypoxie, ztráta kontaktu s okolními strukturami (buňkami, ECM), nepřítomnost signálů přežití, signály smrti,… Regulace a průběh apoptózy 1. Signalizace přes receptory 2. Vnitřní signalizace (mitochondrie) 3. Efektory apoptózy Mitochondrie jako integrátory apoptotických signálů proteinová rodina Bcl-2 Mitochondrie jako integrátory apoptotických signálů anti-apoptotický protein Bcl-2 Získání neomezeného replikačního potenciálu Většina buněk lidského těla se nemůže dělit do nekonečna, ale naopak má naprogramovaný (tzn. určený vnitřními faktory) konečný počet buněčných dělení, kterými může projít. 4 Získání neomezeného replikačního potenciálu Většina buněk lidského těla se nemůže dělit do nekonečna, ale naopak má naprogramovaný (tzn. určený vnitřními faktory) konečný počet buněčných dělení, kterými může projít. 4 Funkce telomer a telomerázy Telomery jsou sekvence na koncích chromozomů. Jejich hlavní funkcí je ochrana konců chromozomů. Telomeráza je enzym, který je nutný pro udržování stabilní délky telomer. Většina buněk neexprimuje telomerázu a telomery se proto progresivně zkracují při každém buněčném dělení. chromozomální DNA telomerická DNA KRIZE 4 Získání neomezeného replikačního potenciálu 85 až 90% nádorů má aktivní telomerázu. Indukce angiogeneze Schopnost nádorů přesáhnout svou velikostí masu o průměru větší než 1 mm závisí na jejich schopnosti zajistit přístup ke krevnímu systému. 5 Tvorba metastáz • Metastázy jsou nejzhoubnějším jevem při nádorovém onemocnění a jsou příčinou asi 90 % úmrtí pacientů s nádorovým onemocněním. • Méně častou příčinou je bezprostřední působení primárního nádoru: nádory mozku, nádory žlaznatých buněk, leukémie, lymfomy 6 Metastatická kaskáda 1. Uvolnění nádorové buňky z primárního nádoru. 2. Prostoupení ECM a bazální membrány, vstup do cirkulačního systému. 3. Migrace cirkulačním systémem. 4. Vystoupení z cirkulačního systému, prostoupení bazální membrány a ECM. 5. Tvorba sekundárního nádoru (metastázy). Invazi nádorových buněk lze chápat jako pohyb buněk spojený s regulovanou adhezí a uvolňováním adheze (od ECM, mezi buňkami navzájem) a proteolýzou ECM. Vývoj nádorů trvá roky Navýšení genetické nestability Z výpočtu, který vycházel ze známé mutační rychlosti v somatických buňkách (10-6 na gen na generaci buněk), se zdálo, že k takové akumulaci mutací nemůže během lidského života dojít. Jakým mechanismem dochází k této akumulaci? Nádory jsou geneticky nestabilní, tj. je u nich vyšší rychlost, s jakou dochází k mutacím. 7 Vývoj nádorů trvá roky Sedm typických znaků nádorových buněk (2000) • zánět podporující nádor (8) • přeprogramování energetického metabolismu (9) • únik imunitní odpovědi (10) • vliv mikroprostředí nádoru (11) Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 144 (2011) 646-674 Hanahan D. and Weinberg R.A., Cell 100 (2000) 57-70 Jedenáct typických znaků nádorových buněk (2011)  Jak vznikají nádory  Kterými vlastnostmi se liší nádorová buňka od zdravé? • poškození regulace buněčného dělení • poškození programované buněčné smrti • získání neomezeného replikačního potenciálu • indukce angiogeneze • tvorba metastáz • navýšená genetická nestabilita  Lymfomy, lymfocyty, protilátky  Vývoj B lymfocytů  Vznik lymfomů  Závěr Jak vznikají lymfomy Osnova Co jsou lymfomy • nádorové onemocnění lymfatického systému • nádory, které pocházejí z lymfocytů, jednoho druhu bílých krvinek různé typy lymfomů  liší se agresivitou, prognózou, způsobem léčby  diagnostikovány na základě: • morfologie • imunofenotypických znaků • cytogenetických a molekulárně-biologických znaků (např. podle výskytu typických chromozomových translokací) Nejčastější B lymfomy  difúzní velkobuněčný B-lymfom – DLBCL (30 %)  folikulární lymfom - FL (22 %)  MALT lymfom (8 %)  chronická B-lymfatická leukémie/lymfocytární lymfom - B-CLL (7 %)  lymfom z buněk plášťové zóny - MCL (6 %) Co jsou B lymfocyty • buňky imunitního systému zodpovědné především za specifickou imunitní odpověď zprostředkovanou protilátkami • někdy označovány jako B buňky • morfologicky jsou to kulaté mononukleární buňky s malým množstvím cytoplazmy Chromozomové translokace • reciproké translokace jsou vzájemné, reciproké výměny segmentů mezi dvěma nehomologními chromozomy • počet chromozomů zůstává stejný • důsledkem translokací: (1) chimerické proteiny, (2) změněná exprese intaktního proteinu, (3)… žádný (?) Co jsou protilátky • látky bílkovinné povahy, patřící do rodiny imunoglobulinů • specificky se váží na antigen • v průběhu specifické imunitní odpovědi jsou tvořeny B lymfocyty a plazmatickými buňkami, které vznikají z B lymfocytů v rámci terminální diferenciace Struktura protilátky • složena ze dvou totožných těžkých (H - heavy) a dvou totožných lehkých řetězců (L - light) • řetězce jsou vzájemně svázány kovalentními disulfidickými můstky • sestávají z variabilní a konstantní domény • variabilní domény lehkého i těžkého řetězce vytvářejí vazebné místo Kolik má člověk v těle různých protilátek? 1011 různých protilátek !! tj. 100 000 000 000 Kolik má člověk genů ve svém genomu? ~ 20 000 Kolik má člověk genů ve svém genomu? ~ 20 000 vs. 100 000 000 000 Kolik má člověk genů pro protilátky? 3 geny Kolik má člověk genů pro protilátky? • jednotlivé řetězce jsou kódovány 3 geny (genovými komplexy) ležícími na různých chromozomech: IgH pro těžký řetězec μ na lidském chromozomu 14, IgL a IgK pro lehký řetězec λ a κ na chromozomech 2 a 22 • geny kódující těžké a lehké řetězce imunoglobulinů se skládají z několika segmentů odpovídajících příslušným oblastem molekuly receptoru: V (variable), D (diversity, u lehkých řetězců chybí), J (joining) a C (constant) • segmenty V, D a J jsou zodpovědné za strukturu variabilní oblasti imunoglobulinu rozpoznávající antigen, každý z nich obsahuje několik variant 0rganizace genů pro protilátky 0rganizace genů pro protilátky 0rganizace genů pro protilátky  V průběhu zrání B lymfocytů dochází v jejich DNA k tzv. přeskupování neboli V(D)J rekombinaci. • Během tohoto procesu je z každého segmentu náhodně vybrána jedna varianta, která v genomu zůstane, ostatní jsou nenávratně odstraněny. Imunoglobuliny, které zralý B-lymfocyt produkuje, pak u dané buňky (včetně jejího potomstva) mají zcela konkrétní a neměnnou strukturu. • V(D)J rekombinace je náhodný proces, který probíhá nezávisle v každém dozrávajícím B-lymfocytu. Jen pro těžký řetězec imunoglobulinu (IgH) existuje 45 000 variant, pro lehký (Igκ a Igλ) 70 × 5 + 30 × 9 = 620 variant; ty lze mezi sebou libovolně kombinovat, výsledný počet možných struktur molekuly imunoglobulinu je 45 000 × 620 = 27 900 000.  Toto množství je ještě umocněno aktivními somatickými hypermutacemi, ke kterým dochází v poslední fázi dozrávání B- lymfocytů.  Jak vznikají nádory  Kterými vlastnostmi se liší nádorová buňka od zdravé? • poškození regulace buněčného dělení • poškození programované buněčné smrti • získání neomezeného replikačního potenciálu • indukce angiogeneze • tvorba metastáz • navýšená genetická nestabilita  Lymfomy, lymfocyty, protilátky  Vývoj B lymfocytů  Vznik lymfomů  Závěr Jak vznikají lymfomy Osnova Vývoj B lymfocytů (1) Prekurzory B lymfocytů vznikají dělením pluripotentní hematopoietické kmenové buňky v kostní dřeni, kde - bez přítomnosti antigenu - probíhá první část vyzrávání B lymfocytů. Dochází k přeskupování genových segmentů – V(D)J rekombinaci - nejdříve těžkých a pak lehkých řetězců. Nezralé B lymfocyty pak exprimují na svém povrchu přeskupený receptor a prodělávají selekční procesy: testována je autoimunita a schopnost přežít v periferních lymfatických tkáních. Vývoj B lymfocytů (2) Naivní B buňky jsou vyplavovány do krve a následně do periferních lymfatických orgánů (slezina, lymfatické uzliny, tonzily,…), kde se setkávají s antigeny. Po aktivaci intenzivně proliferují a tvoří zárodečná centra (GC). V GC probíhají dva klíčové procesy: somatické hypermutace (SHM) a izotypové přepnutí (CSR). (3) Přeměna na plazmatickou buňku (opět v kostní dřeni) produkující protilátku a paměťovou buňku. Úloha zárodečného centra (GC) v diferenciaci B lymfocytů • Zárodečná centra (germinální centra - GC) jsou místa v sekundárních lymfatických orgánech, kde zralé B lymfocyty proliferují, diferencují a kde probíhají somatické hypermutace a izotypové přepnutí (například z IgM na IgG) během normální imunitní odpovědi na infekci. Úloha zárodečného centra v diferenciaci B lymfocytu • Tmavá zóna GC je tvořena rychle se dělícími centroblasty, u kterých dochází k somatickým hypermutacím. Spojeno s intenzivní proliferací. • Proliferující B lymfocyty vytlačují klidové buňky na periferii foliklu, kde tvoří tzv. plášťovou zónu. • Světlá zóna je tvořena nedělícími se centrocyty, u kterých dochází k izotypovému přepnutí. Vznikají paměťové a plazmatické buňky. Spojeno s masivní apoptózou a diferenciací. Úloha zárodečného centra v diferenciaci B lymfocytu Pro diferenciaci antigenem aktivovaných B buněk jsou typické: • výrazná proliferace • snížená citlivost na poškození DNA (SHM, CSR) • aktivní telomeráza • silná vnímavost k apoptóze  Jak vznikají nádory  Kterými vlastnostmi se liší nádorová buňka od zdravé? • poškození regulace buněčného dělení • poškození programované buněčné smrti • získání neomezeného replikačního potenciálu • indukce angiogeneze • tvorba metastáz • navýšená genetická nestabilita  Lymfomy, lymfocyty, protilátky  Vývoj B lymfocytů  Vznik lymfomů  Závěr Jak vznikají lymfomy Osnova Poškození DNA vznikající v zárodečných centrech • Chyby v procesech somatických hypermutací (SHM) a izotypového přepnutí (CSR), které jsou fyziologicky cíleny na imunoglobulinové řetězce, mohou: • způsobit hypermutace nebo translokace některých protoonkogenů (BCL6, cmyc, BCL2, CCND1, NF-κB a dalších) a • být příčinou vývoje některých nehodgkinských lymfomů. Chyby v SHM a CSR vedou k vývoji lymfomů • Burkittův lymfom: t(8;14)   c-myc • Folikulární lymfom: t(14;18)   BCL2 • Lymfom z buněk plášťové zóny: t(11;14)   cyklin D1 • Difúzní velkobuněčný lymfom B buněk: aberace BCL6, NFκB, PRDM1, c-myc, … • Lymfoplasmacytoidní lymfom: t(9;14)  PAX5 B-CLL MCL (IgH-CCND1) Regulace buněčného cyklu Cyklin D1 a lymfom z buněk plášťové zóny (MCL) Typickým znakem MCL je translokace t(11;14)(q13;q32). Jejím důsledkem je fúze transkripčního zesilovače genu IgH pro těžký imunoglobulinový řetězec μ na chromozomu 14q32 a genu CCND1 (BCL1) kódujícího cyklin D1 na chromozomu 11q13, a následně vysoká exprese cyklinu D1. Onkoprotein Myc a buněčný cyklus • Dimer Myc-Max indukuje expresi cyklinu D2 a CDK4  BC (G1) • Dimer Myc-Mac indukuje expresi Cul1, který zprostředkovává degradaci p27  BC (G1) • Dimer Myc-Max indukuje expresi E2Fs  BC (S) • Dimer Myc-Miz-1 reprimuje expresi p15, p21 a p27  BC (G1) c-myc a Burkittův lymfom • Téměř všechny případy BL souvisí s translokací genu c-myc (chromozom 8) buď s genem pro těžký imunoglobulinový řetězec  (chromozom 14) nebo lehký řetězec  nebo  (chromozomy 2 a 22). • 80% případů BL má translokaci t(8;14)(q24;q32). • Případů s translokacemi t(2;8)(p11;q24) a t(8;22)(q24;q11) je asi po 10%. Mitochondrie jako integrátory apoptotických signálů anti-apoptotický protein Bcl-2 BCL2: B-cell leukemia/lymphoma 2 • první apoptotický gen objevený v savčích buňkách díky své roli v maligní přeměně B-buněk. Objeven v r. 1984 (Tsujimoto) jako produkt translokace t(14;18) u buněčné linie B-ALL • poprvé popsána nová třída proto-onkogenů: ne aktivátory buněčné proliferace, ale represory buněčné smrti • Folikulární lymfomy (+cca 30% DLBCL) často nesou translokaci t(14;18), ta vede k vysoké expresi bcl-2 Další onkogeny zapojené do vývoje lymfomů MYC, BCL2, CCND1 (BCL1) BCL6 • lokalizován v pozici 3q27 • nutný pro vytvoření GC • transkripční represor mnoha genů účastnících se apoptózy, odpovědi na poškození DNA, regulace buněčného cyklu, proliferace a diferenciace; cílové geny např. BCL2, p53, IRF4 • „vypnutím p53“ umožňuje somatické hypermutace a izotypové přepnutí (tj. rekombinace) • aberace BCL6: hypermutace, translokace - 50% s Ig lokusem, 50% jiní partneři • translokace BCL6 u asi 30-40% DLBCL, některých FL, MALT MYC, BCL2, CCND1 (BCL1), BCL6 BCL3 • lokalizován v pozici 19q13 • člen rodiny IB • účastní se vytváření GC • translokace t(14;19) se vyskytuje u řady leukémií a lymfomů Další onkogeny zapojené do vývoje lymfomů Chyby v SHM a CSR vedou k vývoji lymfomů • Burkittův lymfom: t(8;14)   c-myc • Folikulární lymfom: t(14;18)   BCL2 • Lymfom z buněk plášťové zóny: t(11;14)   cyklin D1 • Difúzní velkobuněčný lymfom B buněk: aberace BCL6, NFκB, PRDM1, c-myc, … • Lymfoplasmacytoidní lymfom: t(9;14)  PAX5 B-CLL MCL (IgH-CCND1) Chromozomální translokace vyskytující se u lymfomů • tyto typické chromozomální přestavby (a hypermutace) jsou nejenom charakteristické pro určité typy lymfomů, ale považují se také za změny primární, iniciující vývoj nádoru  Jak vznikají nádory  Kterými vlastnostmi se liší nádorová buňka od zdravé? • poškození regulace buněčného dělení • poškození programované buněčné smrti • získání neomezeného replikačního potenciálu • indukce angiogeneze • tvorba metastáz • navýšená genetická nestabilita  Lymfomy, lymfocyty, protilátky  Vývoj B lymfocytů  Vznik lymfomů  Závěr Jak vznikají lymfomy Osnova Místo závěru: double-edged sword Výhoda 1011 různých protilátek Nevýhoda riziko lymfomů  advanatge with liability Výhoda 1011 různých protilátek liability: přítěž, břímě, překážka, odpovědnost, závazek, náchylnost, povinnost,… Nevýhoda riziko lymfomů Místo závěru: double-edged sword Děkuji za pozornost!