Klonování (nejen) člověka Petr Vaňhara, PhD Ústav histologie a embryologie LF MU Trnitá cesta Klonování je podle běžné definice vytváření nového jedince geneticky identického (shodného) s předlohou. • Molekulární • Buněčné • Terapeutické • Reprodukční G2/M zástava mitotické dělení růst (měsíce až rok) meiotické zrání (hodiny) PGC & oogonie MI MII Znovuzahájení meiózy Zastavení meiózy v diplotene 1. meiotického dělení Vajíčko schopné oplození a podpory embryonálního vývoje Oocyt Obrovská, vysoce specializovaná , totipotentní buňka S unikátní regulací buněčného cyklu Vývoj oocytu DiploteneI.meiotickéhodělení IOvarium 30 mm 20 mm Výběr dominantního folikulu (nejcitlivější k FSH) Preantrální folikul (časné stádium) Rekrutovaný folikul Antrální folikul (střední velikost) Preovulační fol. (velký) Primordiální folikul ~14 dní FSH- independentní Masivní produkce hormonů Androstendion Theca folliculi interna Estradiol Granulózní buňky Pomalý, u člověka několikaměsíční proces 100x zvětšení objemu – akumulace organel a molekul dávajících vajíčku schopnost podporovat vývoj embrya až do okamžiku získání autonomie (asi 105 mitochondrií oocytu podporuje vývoj embrya až do stádia blastocysty) Intenzívní transkripce - akumulace mRNA v dormantním stavu Plně vyrostlý oocyt – ~2,5 ng RNA Intenzívní translace – mnoho proteinů (velmi omezené znalosti) Příklad: ZP1, ZP2, ZP3 – proteiny zona pellucida Plně vyrostlý oocyt – ~120 ng proteinu Transkriptom a proteom – podmiňují unikátní vlastnosti oocytu Růst oocytu Reaktivace X chromozomu • somatické buňky – jeden X chromozom inaktivován hypermetylací cytozinů v molekule DNA • rostoucí oocyt – oba X chromozomy aktivní (nutné pro vývoj oocytu – karyotyp 45, X0 má za následek abnormální vývoj ovária) Genomický imprinting • epigenetická modifikace autozomálních chromozomů vedoucí k monoalelické expresi genů - umožněna aktivitou enzymu DNA metyltransferázy • PGC jsou globálně demetylovány • během růstu oocytu dochází k novému ustavení imprintingu (asi 40 genů) & Abnormality v imprintingu mohou být důvodem spontánních abortů při asistované reprodukci (in vitro manipulace s gametami a embryi může vést k abnormalitám v imprintingu) Epigenetické změny odehrávající-se během růstu Hormonální regulace ovariálního cyklu Hypotalamus Hypofýza Gonadotropin-releasing hormon (pulzy) Růst folikulů Meiotická maturace + Ovulace Corpus luteum Gonadotropiny FSH LH Menstruační f. Proliferační fáze Sekreční (luteální) fáze Ischemická Menstruační f. 0 5 14 28 527 Estrogen Progesteron + Estrogen Implantace blastocysty 0 5 14 28 Menstruační fáze Proliferační fáze (estrogeny) Sekreční fáze (progesteron) Ovulace následovaná Oplozením Funkční zóna endometria kompaktní + spongiózní + bazální Stroma Syncytiotrofoblast Embryoblast Epitel Trofoblast Molekulární hráči Selektin na trofoblastu + glykoproteiny na epitelu Integriny + Laminin, Fibronektin IGF1, IGF2, VEGF Metaloproteinázy + jejich tkáňové inhibitory Progesteron hCH Prostaglandiny Časná embryogeneza – Druhý týden Ukončení implantace + Další embryonální vývoj • Pokračující invaze do endometria • Destrukce kapilár a žlázek • Pohlcování apoptotických buněk (Fas/Fas ligand) Trofoblast Cytotrofoblast • Mitoticky se dělící buňky (jedna vrstva) • Zdroj buněk syncytiotrofoblastu Syncytiotrofoblast • Fůzované buňky (nědělící se, mnohojaderné) • Produkce hCG (stimuluje CL)Lakuny trofoblastu Syncytiotrofoblast Děložní žlázka Endometriální kapilára Cytotrofoblast Amniová dutina Hypoblast Blastocoel Embryonální pól Abembryonální pól Stav ve dni 8 Epiblast  Organogeneze a vývoj tkání BMP-4 Noggin Chordin Follistatin BMP-4 v celém embryu, ventralizace endo- a mesodermu • V budoucím notochordu, primitivní jamce, prechordálním mesodermu • Inhibují BMP-4 • Neuralizace ektodermu a vývoj předního a středního mozku Noggin Chordin Follistatin FGF Wnt3a FGF Wnt3a • Kaudální neurální struktury – zadní mozek a mícha  Neurulace KLONOVÁNÍ A EXPERIMENTÁLNÍ EMBRYOLOGIE Epigeneze nebo preformace? William Harvey ex ovo omnia Antonie van Leeuwenhoek spermatozoa Nicolaas Hartsoeker homunculus Nicolas Malebranche embryos ad infinitum Hans Adolf Edward Dreisch 1885 – Každá z buněk raného embrya může dát vznik celému organismu JEŽOVKA Nenáročný organismus, velký oocyt i embrya výborný model pro studium vývojové biologie Hypotéza: vyvine se z disociovaných buněk raného, dvoubuněčného embrya příslušná část těla ježovky? Závěr: Každá z blastomer má kompletní instrukce pro vytvoření celého organismu MLOK Embrya mloků „drží“ mnohem více pohromadě než embrya ježovek. Experiment: Blastomery mechanicky rozděleného dvoubuněčného embrya umožnují vývoj normální embryonální vývoj. Hans Spemann 1902 – Funguje to i obratlovců! Ale rozdělení pozdějšího embrya, není zdaleka tak úspěšné. Buňky rozdělených embryí se mohou vyvíjet pouze do určitého stádia embryogeneze Hans Spemann 1928 – Embryonální vývoj kontroluje buněčné jádro MLOK Ligací oocytu dochází k vývoji pouze v oblasti s buněčným jádrem Návrat jádra do původní oocytární cytoplazmy a jeho odškrcení v 8-buněčném stádiu indukuje vývoj samostatného embrya Jádra buněk do 8-buněčného stádia jsou vývojově totipotentní 1938 – první idea klonování: „fantastický experiment“ Hanse Spemanna náhrada jádra oocytu jádrem jiné somatické buňky a následný vývoj embrya Mikromanipulace s oocytem Robert Briggs a Thomas King 1952 – První úspěšný přenos jádra ŽÁBA (Skokan leopardí, Rana pipiens) Přenos jádra z žabího embrya do enukleovaného oocytu V případě raných donorů, byla úspěšnost normálního vývoje pulců vysoká. Jádra starších donorů zdaleka tak úspěšná nebyla – přežívající pulci s výraznými vývojovými abnormalitami Endodermální jádro embrya ve stádiu embrya neumožnuje normální vývoj Drápatka vodní (Xenopus laevis) Vysoká citlivost na FSH a LH Rezistence k chorobám Snadný chov Výborný embryologický model 1930 – nová laboratorní hvězda John Gurdon ŽÁBA (Xenopus laevis) Samotná oocytární cytoplazma umožnuje přeprogramování jádra pouze do určitého stádia vývoje 1952 – První úspěšný přenos jádra somatické diferencované buňky John Gurdon ŽÁBA (Xenopus laevis) Jádro somatické determinuje fenotyp vyvíjejícího se zárodku 1952 – První úspěšný přenos jádra somatické diferencované buňky I diferencované, somatické buňky z plně vyvinutého organismu obsahují veškerou genetickou informaci nezbytnou k úspěšnému embryonálnímu vývoji Pro správný embryonální vývoj jsou nezbytné geny exprimované pouze během rané embryogeneze Oocytární cytoplazma umožnuje přeprogramování jádra pouze do určitého stádia vývoje Kmenové buňky se liší ve schopnosti diferenciace Totipotence - Všechny buňky těla včetně extraembryonálních tkání - Zygota a raná stádia Pluripotence - Všechny buňky těla s výjimkou trofoblastu - Blastocysta – Inner cell mass - ICM (embryoblast) Multipotence - Různé buněčné typy v rámci tkáně - Mesenchymální SC, hematopoietické SC http://www.embryology.ch/anglais/evorimplantation/furchung01.html Oligo- a unipotence - Jeden nebo několik buněčných typů – hematopoietické buňky, tkáňové prekurzory (obnova epitelů apod.)  Indukované pluripotentní kmenové buňky mají vlastnosti embryonálních kmenových buněk hESCs hiPSCs J. Derek Bromhall KRÁLÍK přenos jádra a embryonální vývoj do stádia moruly Bromhall v experimentu nepokračoval 1975 – První savčí embryo vytvořené přenosem embryonálního jádra Steen Willadsen 1984 – První narozený savec vytvořený přenosem embryonálního jádra OVCE separace buněk z 8-buněčného embrya fúze s enukleovaným oocytem embryotransfer a narození tří jehňat KRÁVA Wilandsenova technika přenosu embryonálních jader telata „Fusion“ a „Copy“ použití somatických jader v savčím klonování považován stále za nemožné Neal First, Randal Prather, Willard Eyestone 1987 – Další úspěšné experimenty s přenosem embryonálních jader OVCE zdroj jader - ovčí buňky kultivované in vitro 6-12 pasáží indukce klidové G0 fáze absencí růstových faktorů v médiu hypotéza: klidový stav buněk umožnuje efektivní reprogramování a vývoj závěr: nejen totipotentní ale i diferencované nebo modifikované buňky mohou sloužit jako donory jader pro vznik zvířat se specifickým genotypem nebo dokonce jeho modifikací (produkce insulinu v mléku) Ian Wilmut a Keith Campbell 1996 – Přenos jader embryonálních buněk kultivovaných in vitro a vznik živatoschopných zvířat Megan a Morag OVCE přenos jádra vysoce diferencované somatické buňky, mammárního fibroblastu nutné reprogramování epigeneticky vysoce modifikovaného chromatinu 433 oocytů 277 úspěšných fůzí 29 životaschopných embryí 1 Dolly Ian Wilmut a Keith Campbell Dolly 1996 – Průlomový experiment – úspěšný přenos jader somatických buněk HELLO DOLLY! 6LL3 „Dolly“ Dolly a Bonny OVCE lidský Faktor IX PDFF poll dorset fetal fibroblasts lipofekce DNA faktor IX 82 embryií 5 embryotransferů 3 životaschopná jehňata Polly Angelika Schnieke, Keith Campbell, Ian Wilmut 1997 – jaderný přenos geneticky modifikovaných buněk 1998-99 – klonování různých savců Myši, kozy, mufloni, gaur plány na klonování ohrožených i vyhynulých zvířat MAKAK RHESUS subhumánní experimentální model 29 klonů, 2 životaschopní makakové dosud jediní klonovaní primáti neobyčejná obtížnost úspěšného přenosu jader a embryonálního vývoje Li Meng, John Ely, Richard Stouffer, Don Wolf 1997 – první primát po přenosu jader embryonálních buněk Neti a Ditto Hwang Woo-Suk 2005 – první klonovaný pes Snuppy Toppy Hwang Woo-Suk 2005 – první klonovaná lidská embrya ? Hwang Woo-Suk 2004-2005 – podvod století Únor 2004 Tým Dr. Hwang Woosuk's zvěřejnil úspěšné vytvoření 30 klonovaných lidských embryí a hESCs Květen 2005 buněčné linie kmenových buněk z kožních buněk 11 lidí Listopad 2005 Hwang přiznáva a omlouvá se za nedobrovolné odběry oocytů 15 prosince 2005 jeden z členů týmu udává, že výzkum z roku 2005 je manipulovaný 23 prosince 2005 Nezávislý akademický panel zjišťuje zásadní manipulaci s výsledky z května 2005 10 ledna 2006 Panel zjišťuje že i práce z roku 2004 je zfalšovaná ! MAKAK RHESUS experimentální medicína Shoukhrat Mitalipov 2007 – jaderný přenos somatických buněk primátů Indukované pluripotentní kmenové buňky (IPSc) - dospělá diferencovaná buňka (fibroblast) je dediferencovaná do pluripotentního stavu (reprogramována) - Diferenciace do žádaného buněčného typu - regenerativní medicína, buněčná a genová terapie Nobel prize 2012 Shinya Yamanaka 2006 – senzace století Shoukhrat Mitalipov 2013 – vytvoření lidských embryonálních kmenových buněk somatickým jaderným přenosem ČLOVĚK přenos jader somatických (kožních) buněk do enukleovaného oocytu vznik linií hESCs experimentální medicína, léčba mitochondriálních poruch Stresem Indukované pluripotentní kmenové buňky (STAP) - indukce pluripotence v somatických buňkách je zajištěna vystavením buněk stresovému prostředí Haruko Obokata 2014 – nová senzace století DALŠÍ INFORMACE http://www.isscr.org/ http://learn.genetics.utah.edu/content/cloning/clonezone/ www.osel.cz a zejména prof. Jaroslav Petr The History of Cloning DĚKUJI ZA POZORNOST Petr Vaňhara, PhD. Ústav histologie a embryologie LF MU pvanhara@med.muni.cz http://www.med.muni.cz/histology