Molekulární biologie pro informatiky - 3 Replikace genomu, reparace a rekombinace DNA Replikace DNA Schopnost buňky přežít a množit se závisí na přesném zdvojení genetického materiálu. Při každém dělení musí buňka zkopírovat svůj génom s mimořádnou přesností a dostatečnou rychlostí. Replikace DNA je umožněna párováním bází. Komplementarita řetězců v dsDNA umožňuje, aby po separaci řetězců sloužil každý z nich jako templát pro syntézu nového vlákna. Řetězec S 3' t A 3' 5' Řetězec S' Původní dsDNA Templátový řetězec S <: a ■ J g c <: a g ■ G j A Nový řetězec S' G G j C A Nový řetězec S 5cattg<:cagt3 H t I H I i i t H H Templátový řetězec S' Replikace 1 A Í í 1 1 ^ Replikace iiíi 1111 X A X >*Repllkace 44444444 11111111 http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Replikace DNA 1. iniciace - zahájení replikace (ori), vazba replikačních proteinů, tvorba replikační vidlice 2. elongace - syntéza řetězce DNA 3. terminace - zakončení replikace daného replikonu Počátek replikace (místo ori) • specifická sekvence DNA bohatá na AT páry • vazba iniciačních proteinů otvírá strukturu dsDNA • vazba dalších proteinů zodpovědných za replikaci • přítomen na každém replikonu • u bakterií - lx na chromozomu • u člověka - lO.OOOx na jaderné DNA - 220x na chromozom místo ori 1 - 3' 5' S~ *N 3' 3--S_✓-5' jednořetězcová oblast templátové DNA http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Replikace DNA Replikační vidlice • struktura DNA ve tvaru „Y" během replikace • dvousměrná replikace - dvě vidlice pohybující se v opačných směrech od místa ori • rychlost pohybu - bakterie ~ 1000 nukleotidů / s -člověk ~ 100 nukleotidů / s ,., rephkacni vidlice • tvorba fosfodiesterové vazby mezi dNTP a DNA vm^, http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Replikace bakteriální chromozómové DNA DNA-polymerázy • DNA-dependentní-DNA-polymerázy, 5-> 3' • vyžadují přítomnost primeru (DNA či RNA) 5r I P P P P —Oh ...... 3' 5' 5' __1' p p ü^E^E^E^E^E- ohi 1_ 1. DNA-polymeráza I (Kornbergův enzym) • DNA-primer; odstranění RNA-primerů, syntéza DNA mezi Okazakiho fragmenty opravy DNA 2. DNA-polymeráza II • záložní polymeráza, opravy DNA DNA-polymeráza III 2x katalytické jádro (a, 6, e) - 8 nt/s spojena v dimer (t) - 20 nt/s ß-svorka - stabilizace úseků dsDNA y-komplex (y266'ipx) - nakládání ß-svorky na DNA v místech RNA-primerů 500 nukleotidů/s procesivita pro celu molekulu DNA 3'-5' exonukleázová aktivita RNA-primer; replikace DNA, opravy DNA http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n5/fig_tab/nrm804_F4.html Replikace bakteriální chromozómové DNA DNA-helikáza • odvíjení komplementárních řetězců v dsDNA • DnaB-protein a n'-protein DNA-gyráza • topoizomeráza II • mění kladné nadšroubovicové závity na záporné /* 3' DNA-helikáza DNA-primaza • DNA-dependentní-RNA-polymeráza, syntéza RNA-primerů 3'ho- -Mi 3' 3- Nadšroubovice DNA < _«♦> Ni**"*8 DNA-gyráza RNA-primer Primáza . . » TI" .. i . 5' 3' Řetězec DNA DNA-ligáza • ligace polynukleotidových řetězců • spojení Okazakiho fragmentů ATP aípXpXp) Templátová DNA I I AMP http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Semikontinuální syntéza dsDNA při replikaci Vedoucí DNA řetězec • kontinuální syntéza na řetězci 3'->5' • jeden RNA-primer v místě ori Opožďující se DNA řetězec • diskontinuální syntéza přes Okazakiho fragmenty na řetězci 3'->5' • RNA-primer pro každý Okazakiho fragment, odbourány od 5'-konce • prodloužení Okazakiho fragmentů na 3'-konci, spojení do souvislého řetězce DNA http://www.bio.miami.edu/tom/courses/bil255/bil255goods/09_dna.html http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Iniciace replikace Počátek replikace oriC -13 bp tandemová repetice bohatá na AT páry - 9 bp repetice: vazba DnaA DnaA - rozeznání oriC, převod do otevřené formy DnaB - vazba na otevřený úsek DNA - odvíjení dsDNA, vznik replikačních vidlic SSB-proteiny - vazba na jednořetězcové úseky 13 bp - GATCTNTTNTTTT 9 bp - TTATNCANA i i i /r \ \ m i i m......Hiiiiiiiiiiiii nu nu nn mr -1-- ■-1- 13 bp repetice 9 bp repetice Vazba a akumulace DnaA Ohyb DNA Separace DNA řetězců V I Odvíjení dsDNA 1 Tvorba replikačních vidlic www.studyblue.com http://reasonandscience.heavenforum.org/tl849-dna-replication-of-prokaryotes Elongace replikace • vedoucí řetězec - RNA-primer na počátku replikace • opožďující se řetězce - RNA-primer na začátku každého Okazakiho fragmentu • primozom = komplex DnaB a DnaG (DNA-primáza) Koordinace syntézy obou DNA řetězců ve směru replikační vidlice • ohyb DNA, struktura DNA-polymerázy III • katalytická jádra umístěna každé na jednom matricovém řetězci • y-komplex umístěn asymetricky, opakovaně nakládá (3-svorky na opožďující se řetězec • pohyb katalytického jádra mezi jednotlivými (3-svorkami P-svorka katalytické jádro nově vytvořená DNA RNA-primer nový Okazakiho fragment /—^^t DnaB DnaG ^T^-' opožďující se ,_____* řetězec SSB-protein RNA-primer katalytické jádro katalytické jádro P-svorka SSB katalytické jádro www.studyblue.com http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf Elongace replikace DNA Replication Key Players Helicasp DNA Paíiinieras? Primase Vazba DnaA do místa oriC Odvinutí dsDNA Vazba DnaB, která pokračuje v odvíjení dsDNA DNA-gyráza uvolňuje napětí tvorbou záporných nadšroubovcových závitů SSB-proteiny udržují řetězce DNA oddělené a přístupné replikace Vytvoření replikační vidlice P-arantal DNA Tvorba souvislého řetězce z Okazakiho fragmentů DNA-polymeráza I - postupuje za DNA-polymerázou III - odbourává z 5'-konců RNA-primery - na 3'-konec předchozího Okazakiho fragmentu napojuje dNTP Vazba DnaG a syntéza RNA-primeru na vedoucím řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje vedoucí řetězec Tvorba RNA-primeru na opožďujícím se řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje opožďující se řetězec DNA polyrmeraselll DNA-ligáza - spojuje doplněné fragmenty Tvorba dalších RNA-primerů na opožďujícím se řetězci DNA-polymeráza III syntetizuje Okazakiho fragmenty DNA-polymeráza I odstraňuje RNA-primery a zaplňuje jejich místo DNA □NA polymerase I removing primer ooooo Dkazaki fragrnentfll i r2 □NA polymerase I DNA-ligáza spojuje přilehlé Okazakiho fragmenty do souvislého řetězce DttAgyrase Terminace replikace • terminátor replikace, ter • vazba specifických proteinů, které inhibují DnaB a zastavují tvorbu replikační vidlice • topoizomeráza typu II odděluje vzniklé chromozomy 100 ,(/m academic.pgcc.edu faculty.samford.edu www.brighthubeducation.com schaechter.asmblog.org Replikace plazmidové DNA Replikace plazmidů otáčivou kružnicí • v místě ori štěpí Rep-protein (+) řetězec • vzniklý 3'-konec prodlužován, vytlačení (+) řetězce • zlom (+) řetězec mezi původní a novou DNA, ligace • vzniká (i) kružnicová dsDNA (ii) kružnicová ssDNA (doplnění přes Ok. fr.) Zlom / / H \ \ Replikace /í(_) 5' 3' Replikace konjugativních plazmidů během konjugace • replikaci otáčivou kružnicí, vytlačovaný (+) řetězec přestupuje do recipientní buňky • (-) řetězec zůstává v donorové buňce, kontinuální syntéza • (+) řetězec se v recipientní buňce dosyntetizuje přes Okazakiho fragmenty F plasmid Bacterial chromosome br i' www.studyblue.com http://thegeneticsofvirusesandbacteria.weebly.com/diagrams.html Replikace chromozómové DNA u eukaryot Podobné rysy jako u replikace bakteriálního chromozomu: • semikonzervativní a semikontinuální • replikační vidlice, replikační proteiny • iniciace, elongace a terminace Odlišnosti od replikace prokaryot: • replikace omezena do S-fáze buněčného cyklu • přítomnost nukleozomů • mnohonásobná místa počátku replikace • problém s doreplikováním konců lineární molekuly DNA Počet _ . Velikost Rychlost syntézy DNA „, , „ Druh ... .., , . . počátku genomu (bp) (kbp/min) ... replikace 011 011 on ▼ on ort on E. coli 4,6 x 106 30 1 S. cerevisiae 1,4 x 107 3 330 D. melanogaster 1,8 x 108 2,6 3.500 Mus musculus 2,5 x 109 2,2 25.000 Horno sapiens 3,2 x 109 3 >10.000 ? i + sphweb.bumc.bu.edu http://www.authorstream.com/Presentation/Mansoornabi513-1223311-dna-replication-in-eukaryotes/ Replikace chromozómové DNA u eukaryot DNA-polymerázy u eukaryot nalezeno nejméně 13 druhů 3 replikace jaderné DNA opravy DNA replikace mitochondriální DNA funkce neznámá Y t, k, n, - DNA-polymeráza a • tetramer (RNA-primáza), tvorba RNA-primerů a části Okazakiho fragmentů • mírná procesivita, 5'-3' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza (3 • monomer, syntéza krátkých řetězců při reparaci DNA • nízká procesivita, 5'-3' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza y • dimer, syntéza mitochondriální DNA • vysoká procesivita, 5'-3' a 3'-5' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza 6 • interakce s proteiny RCF a PCNA, dokončení syntézy Okazakiho fragmentů • vysoká procesivita v asociaci s PCNA-proteinem, 5'-3' a 3'-5' exonukleázová aktivita DNA-polymeráza £ • úzce souvisí s 6, hlavní polymeráza pro syntézu vedoucího řetězce Iniciace replikace Replikační počátky po 1 - 300 kbp • na savčích chromozomech bez specifických sekvencí, bohaté na AT páry, 500 - 50.000 bp Pre-iniciační komplex • sestaven v Gl fázi buněčného cyklu • replikační počátek rozeznán proteinem ORC • vazba CDC6, CDT1, MCM2-7 Při vstupu do S-fáze jsou složky pre-iniciačního komplexu fosfo ryl ovány, uvolnění už nepotřebných složek, aktivace MCM2-7 Iniciační komplex • Mcm2-7 spolu s dalšími proteiny (CDC45, GINS) plní funkci DNA-helikázy • vazba DNA-polymeráz do replikační vidlice Výsledkem iniciace je založení replikační vidlice s navázanými proteiny, které se budou účastnit elongační fáze replikace. O— ORCs https://en.wikipedia.org/wiki/Euka ryotic_DNA_replication#/media/File: Pre-replicative_complex.JPG Elongace replikace Vedoucí řetězec • jediný primer vytvořený DNA-polymerázou a • RCF-protein nakládá PCNA na konec RNA-primeru • PCNA-protein vytěsňuje DNA-polymerázu a a zvyšuje procesivitu DNA-polymerázy e, která se na něj váže a syntetizuje DNA 5' Opožďující se řetězec • RPA pokrývá jednořetězcové úseky DNA • DNA-polymeráza a tvoří RNA-primer (10 nt) a část Okazakiho fragmentu (10-20 nt) • PCNA vytlačuje DNA-polymerázu a • RNázaH odstraňuje RNA-primery z 5'-konce • DNA-polymerázou 6 dokončuje Okazakiho f. • DNA-ligáza spojuje Okazakiho f. 3' 5' www.leibniz-fli.de Složky bakteriálního a eukaryotického replizomu Funkce Bakterie Eukaryota Rozpoznání orí DnaA ORC Vazba helikázy k DNA DnaC CDT1, CDC6 Helikáza DnaB MCM komplex Relaxace DNA DNA-gyráza Topoizomeráza II Ochrana ss řetězců SSB RPA Primáza DnaG Polet Syntéza vedoucího řetězce Pol3 Pole Syntéza opožďujícího se řetězce Pol3 Polet, P0I6 Posuvná svorka B-svorka PCNA Nakládání svorky y-komplex RCF Odstranění RNA-primeru Poli RnázaH Dokončení Okazakiho fragmentů Poli P0I6 Spojení Okazakiho fragmentů DNA-ligáza DNA-ligáza Terminace replikace Problém zakončení replikace lineárních dsDNA • po odstranění RNA-primeru na 3'-konci matricového řetězce pro opožďující se řetězec vzniká prázdné místo, které DNA-polymeráza nedokáže zaplnit • bez strategie, jak tento úsek doreplikovat by docházelo ke zkracování chromozomů a ztrátě genetické informace Telomery • druhově specifické repetitivní sekvence • udržovány telomerázou, bez ní dochází ke zkracování telomer (-50-150 bp / dělení) • senescence či smrt buněk po zkrácení telomer pod kritickou hranici • ochrana chromozomů před degradací • rozeznány jako skutečné konce chromozomů, odlišeny od dvou řetězcových zlomů uprostřed chromozomů Leading strand DNA polymerase Sliding clamp Lagging strand IUU1UUUUU Helicase 3' 1! iiiiiiiiiiiiiiiiiiifiniii Primase^ rna 5' primer 3< ľ V^V^V^ Vu/* ^ W'V' 5< 3' 3' _k,lřX,trXi1rX,trXlir,|IIIMI.....I...... DNA polymerase 5' , ; M i -■ 111. i 3' 3- 3; 5' ii,,i„,i,n 3 http://www.uic.edu/classes/bios/bioslOO/lectures/dna.html med.stanford.edu Terminace replikace Telomeráza • ribonukleoproteinový komplex složený z (i) RNA (templát) (ii) RNA-dependentní-DNA-polymeráza vazba k přečnívajícímu 3'-konci DNA přes RNA tento konec je využit jako primer a podle RNA matrice prodloužen o telomerické sekvence syntéza tandemových repetic zajištěna trans-lokací telomerázy podél vznikajícího řetězce na prodlouženém 3'-konci vytvoří replikační enzymy další Okazakiho fragment původní délka chromozomu je zachována přítomna v zárodečných/kmenových buňkách, nepřítomna v somatických buňkách reaktivace v nádorových buňkách 5'I IP A G G G Missing DNA on 5' lagging strand i T A G G I 3 Telomerase with its own RNA template DNA polymerase -X— H Sliding clamp http://www.uic.edu/classes/bios/bioslOO/lectures/dna.htm Terminace replikace Ochrana přečnívajících 3'-konců chromozomů • telomerické sekvence se ohýbají a vytvářejí strukturu telomerické smyčky (T-smyčka) • ssDNA na konci řetězce se zanořuje do dsDNA úseku a tvoří trojvláknovou strukturu (D-smyčka) • celou strukturu stabilizuje komplex proteinů = shelterin - ochrana před endonukleázami, potlačení oprav DNA, regulace telomerázy TPP1 D-loop Replikativní senescence • způsobena zkrácením telomer a rozpadem T-smyčky • buňky zastaví růst, vstoupí do senescence nebo spustí apoptózu • obrana před nestabilitami v genomu a vývojem nádorů (telomery by byly rozeznány jako poškození DNA, odhalené konce by mohly vést k fúzi chromozomů) www.researchgate.ne www.ch.ic.ac.uk Nukleozomy během replikace Během Gl a S fáze buněčného cyklu syntetizovány histony nutné pro zdvojení nukleozomů během replikace DNA. „Lehké" /SSk médium Replikace Izolace oktamerů Izolace oktamerů J_ Centrifugace -í- J_ Centrifugace Jeden pruh, oktamery s „těžkými" AK Široký pruh, f1 oktamery se směsí <■» starých a nových histonů | („těžké", „lehké" AK) I Recyklace H3-H4 H3-H4 j:___ rozpad nukleozomů během replikace rychlé opětovné sestavení nové oktamery jsou náhodnou směsí původních a nových histonů http://www.jbc.org/content/280/13/12065.full http://www.nature.com/nsmb/journal/v22/n8/full/nsmb.3067.html?WT.ec_id=NSMB-201508&spMailinglD=49254359 Přesnost replikace DNA Chybovost DNA-polymerázy: 1 chyba na 107 bází Přesnost replikace zajištěna párováním bází a vlastnostmi DNA-polymerázy (i) přednostní připojení nt se správným párováním (ii) odstranění chybného nt procesem zvaným proofreading Proofreading • kontrola správného párování začleněných nukleotidů během replikace • špatně začleněný nukleotid odstraněn 3'-5' exonukleázovou aktivitou • polymerační a korekční aktivita DNA-polymerázy zajištěna různými katalytickými doménami enzymu DNA-polymeráza \ ^ I i Tem plátový 31 řetězec Připojení chybného nukleotidu Odstranění chybného nukleotidu "I.ill ■ ■ Správně párovaný 3'-konec umožňuje připojení dalšího nukleotidu "lilii :3( 1 4 I ■ http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf http://reasonandsc Molekulární podstata mutageneze zachování genomu buněk vyžaduje - přesnost replikace DNA - schopnost opravit poškozenou DNA mutace jsou dědičné změny genotypu, jejichž molekulární podstatou jsou nukleotidové substituce, delece a inzerce Substituce • výměna nukleotidu • synonymní substituce: vznik kodónu se stejným smyslem AAG (Lys) —> AAA (Lys) • nesmyslná mutace: vznik terminačního kodonu AAG (Lys) —> TAG (STOP) • neutrální substituce: změnou aminokyseliny se nemění konformace peptidového řetězce AAG (Lys) —> AGG (Arg) • mutace měnící smysl kodonu AAG (Trp) —> ACG (Thr) Substituce •ni Inzerce ._■_. Delece -3F- A A . [ijrii i i . (i; www.bbc.co.uk Molekulární podstata mutageneze Delece, inzerce • ztráta / vložení nukleotidu(ů) • posunové mutace: změna čtecího rámce jednonukleotidová inzerce Extra A ! DNA 3' Ur /;\ > II 1> <* /.\ h\ l.\ (e (>i {ty /a 11 l[|<;> 5' RNA 5' g g AUGAAGUUUGGCUAA l' 1 -1' = = Stop 3. i , ,.. 77 5' G G C auguaaguuuggcuaa Extra U 3' 5' 5' n missing t*. i*, v. h ^ o "5 _' C' "__j5- g g c Q missing a u g a a g u u|g g c u a a ■3' □M Stop EH3 trinukleotidová delece missing c g atgtttggctaa missing auguuuggcuaa Met í Pho [ Gly Stop Standardní alela: převládá v populaci, funkční Mutantní alela: četnost v populaci nepřesahuje 1 %, nemusí být funkční Spontánní mutace: vznikají bez účinku mutagenu Indukované mutace: vyvolané mutagenem Mutagen • fyzikální nebo chemické agens vyvolávající mutace, působí genotoxicky, poškozují genotyp • promutagen přeměněn na mutagen metabolickou aktivací http://www.slideshare.net/kristenw3/mutations-13330478 Spontánní mutace Pokud není chybné párování bází opraveno, dochází při dalších replikacích k fixaci mutace. První replikace Mutantní molekula j q j Standardní molekula Druhá replikace t (c; t Standardní molekula t g t_ Standardní molekula Chybné páry bází mohou vzniknout během replikace díky chemickým vlastnostem bází a těmto dějům: 1. Tautomerní změny bází • stabilní tautomery podléhají Watson-Crickovu párování • přechodné tautomery mohou tvořit páry AC, GT • frekvence výskytu 10~4 - 10~5/ na nukleotid a replikační cyklus Tymin KETO forma ENOL forma N H O' O' H Cytozin AMINO forma IMINO forma OH T O ^ H Guanin KETO forma NH 1X > N H Adenin AMINO forma ľ T > ENOL forma NH2 IMINO forma https://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Nucleic_Acid/Nitrogenous_Bases Spontánní mutace 2. Kolísa vo st párování bází • vznik párů CT, G A, TG 3. Depurinace a depyrimidinace • přerušení glykosidické vazby mezi bází a cukrem, ztráta báze, vznik AP místa • po replikaci může vzniknout substituce (přednostně A) či delece • několik tisíc událostí / den v genomu savců Mutantni molekula biotechkhan.wordpress.com http://www.garlandscience.com/res/pdf/ecb4_ch6_draft.pdf www.mun.ca Spontánní mutace 4. Deaminace Cytozin Adenin H A n \ h Uracil Hypoxantin + Adenin + Cytozin G C —> AT AT—>GC Guanin h h Xantin blok replikace DNA 5. Inkorporace uracilu do DNA • místo tyminu, odstraňován uracil-DNA-glykosylázou 6. Oxidatívni poškození DNA • vyvolává především hydroxylový radikál (OH*) • 8-oxodeoxyguanozin (8-OxodG) se přednostně páruje s A • tyminglykol zastavuje replikaci ch thymine 0 1 UV ÍR oxidative damage thymine glycol o ch, HO HÜ n oxidation V guanine 8-oxoguanine H 8-oxoG (G0):C H-N I 1 ' 0 8-oxoG (GO)-A www.mdpi.com Indukované mutace - chemomutageny Analogy bází • purinové a pyrimidinové deriváty • např. 5-brómuracil: analog tyminu, AT —> GC * O- - -H-NB O-H- - -O R O 5 BrU (keto) Adenine O---H-N 5-BrU (enol) Guanine Kyselina dusitá (HN02) • oxidatívni deaminace bází, AT <- • vznik v žaludku z NaNO. ■> GC H NHa H \ / \: C- -C J \ / HN02 + H-C N —» H-C \ / \ N- ■CL X / % / sugar sugar Cytosine \ N—H + H20+N2 Uracil Hydrogensiřičitan (HS03~) • deaminace Q GC—>AT http://slideplayer.com/slide/2816043/ https://en.wikipedia.org/wiki/5-Bromouracil wiki.chemprime.chemeddl.org pubs.rsc.org Indukované mutace - chemomutageny Alkylační látky • alkylace nukleofilních center bází DNA, atomy dusíku a kyslíku • jednofunkční - jedna reaktivní skupina, alkylace bází, změna párování - př. ethylmetansulfonát (EMS) / -h—n WJ/ Vh- - ^ H3C CH2 n o EMS f Ň^f V--h-n=< o ch, n-h---o X HjC-CH2—o-s-ch, n-h---o h Ä h Guanine Cylosine 06-ethylguanine Thymine dvojfunkční - dvě reaktivní skupiny, křížové vazby mezi dvěma nukleofilními centry - zástava replikace DNA, př. yperit (hořčičný plyn) Cl—CH2—CH2 \ yperit ^N—CH3 Cl—CH2—CH2 Cl NhL \ / 3 cisplatina Pt / \ Cl NhL hn ^ A.J h2n' n I h2c—n—ch I I h2c ch2 I I ■N N > < n n \ / DNA DNA nh n nh2 H3N NH3 H2N^N^-N N^N^NH2 Pt(ll) V. -G-G- NH, -G-G- H3N ,NH3 \ / /\ -G-G- Indukované mutace - chemomutageny Psoraleny • interkalace mezi sousední nukleotidy, posunové mutace • fotoreaktivace UVA světlem vede k tvorbě monoaduktů a křížových vazeb na DNA, zástava replikace Psoralen NH UVA (1. foton) -► DNA Xantotoxin DNA UVA (2. foton) NH -► Monoadduct N O UVA UVA Interkalace Monoadukt Křížová vazba OCHj Křížová vazba Polyaromatické uhlovodíky • interkalace do dsDNA, metabolickou aktivací vznikají epoxidy které tvoří monoadukty s DNA • př. benzo(a)pyren DNA http://www.google.com/patents/US6187572 http://www.nature.com/bmt/journal/v33/nl/fig_tab/1704284f2.html https://www.researchgate.net/figure/49739612 Indukované mutace - promutageny Promutageny jsou samy o sobě neškodné. Vyžadují metabolickou aktivaci, aby se staly mutageny. Benzo(a)pyren • produkt nedokonalého spalování • uhelný dehet, výfukové plyny, cigaretový kouř, grilované maso • vznik epoxidů tvořících adukty s DNA 2-acetylaminofluoren (AAF) • původně vyvinut jako insekticid • vznik N-hydroxy-2-aminofluorenu tvořícího adukty s DNA • nádory jater, močového měchýře, ledvin Aflatoxiny • mykotoxiny produkované plísněmi rodu Aspergillus • kontaminované potraviny (obilniny, olejniny, koření, ořechy) • aflatoxinu M1 jeden z nejsilnějších jaterních mutagenů Dusičnany, dusitany • hnojiva, potravinové konzervanty; potraviny rostlinného i živočišného původu • vznik nitrosaminů, které modifikují báze DNA a mění jejich párování http://pubs.rsc.org/is/content/articlehtml/2015/tx/c4tx00126e JV-Hydroxy-2-AAF Indukované mutace - fyzikální mutageny Rostoucí vlnová délka a klesajíc! energie Ionizující záření • záření s dostatkem energie pro ionizaci atomů a molekul ozářené látky • gama záření, paprsky X, část UV záření • vyvolává vznik modifikovaných bází, křížových vazeb a zlomů DNA 0,0001 nm 0,01 nm 10 nm 1000 nm 0,01 cm 1 cm 1 m 100 m ._J._ Paprsky gama Rentgenovo záření - UV J_1_1_, infračerveně záření ._i_i_■_. Mikrovlny Rádiové vlny ___--"---" Viditel ně světlo " l 40D nm .,1,1 500 nm t 600 nm l ■ i 700 nm Ionizující záření Neionizující záření (i) nepřímý účinek (65 % poškození) - ionizace vody a vznik vysoce reaktivních radikálů - modifikace bází: hydroxylace, deaminace, demethylace H20—-H,0* (excitovaná)—► H + OH H20 *H20++e-H2O^H*+OH e+H20'H20" e" + O, *.o, ■H + OH" (ii) přímý účinek (35 % poškození) - DNA absorbuje energii a ionizuje se, štěpení vazeb a zlomům DNA - př. ozáření dávkou 1 Gy vyvolá v buňce 15 - 60 ds zlomů, > 1000 ss zlomů ds zlom http://slideplayer.cz/slide/1968755/ http://labguide.cz/fluorochromy/ 2012.igem.org teachnuclear.ca Indukované mutace - fyzikální mutageny Ultrafialové záření • nižší energie a specifičtější účinek než ionizující záření, absorpční maximum bází při 254 nm (i) zvýšení frekvence spontánních mutací (ii) tvorba pyrimidinových dimerů - dimerizace dvou sousedních pyrimidinových molekul (nejčastěji tyminové dimery) - kovalentní spojení přes cyklobutanový kruh či (6-4) pyrimidinové fotoprodukty - narušena struktura DNA a replikace earthobservatory.nasa.gov kb.osu.edu Opravy poškozené DNA Ionizující záření Kyslíkové radikály Alkylační činidla Spontánní mutace U V záření Polyaromatické uhlovodíky Ionizující záření cis-platina Replikační chyby Uracil v DNA A P místo 8-OxodG ss zlom Tyminovýdimer (6-4) fotoprodukt Adukty s bázemi Křížové vazby ds zlomy Substituce Inzerce Delece Zástava buněčného cyklu Inhibice transkripce, replikace, segregace chromozómů Mutace, chromozómové aberace Senescence Apoptóza, smrt buňky Vrozené choroby, nádorová onemocnění, stárnutí V buňkách existují mechanismy pomocí kterých buňka rozezná a úplně nebo do určité míry odstraní poškození DNA. Tyto opravné mechanismy jsou katalyzovány různými sadami enzymů. Schopnost opravit poškozenou DNA je zásadní pro udržení integrity genomu buněk a pro normální fungování mnohobuněčného organismu. Typy oprav DNA • úplná oprava - oprava na původní stav bez syntézy DNA • excizní oprava - vyštěpení poškozeného místa, syntéza nepoškozené DNA • tolerantní oprava - obnova funkce DNA bez opravy poškození http://www.naturexom/scitable/content/dna-dam Úplné opravy DNA Fotoreaktivace • odstranění pyrimidinových dimerů v DNA vyvolaných UV zářením • katalyzována fotolyázou (aktivace VIS o vlnové délce 340 - 400 nm) • fotolyáza štěpí cyklobutanový kruh v pyrimidinovém dimeru • fylogenetický konzervativní mechanismus, u savců excizní oprava Přímá oprava alkylovaných bází 06-metylguanin-DNA-metyltransferáza • u lidí MGMT, u bakterií Ada, „sebevražedný enzym" • demetylace 05-metylguaninu na guanin, přenos metyl skupiny na vlastní Cys • deficity MGMT nalezeny u nádorů děložního hrdla, kolorekta, žaludku, jater, glioblastomu Cys-SH Cys-S-CH3 aktivní inaktivní MGMT H N r XT J** H2N^N"^N I R https://quizlet.com/11580914/chapter-25-slides-flash-cards/ Excizní opravy DNA Třístupňový proces: 1. rozpoznání a vyštěpení poškozené DNA (nukleázy) 2. zaplnění mezery správnými nukleotidy (DNA polymerázy) 3. spojení zlomu v cukr-fosfátové páteři (DNA ligázy) Bázová excizní oprava (BER) • oprava poškozených bází, odstranění U • DNA glykosyláza - rozeznání a odstranění nevhodné báze, tvorba AP míst • AP endonukleáza - vyštěpení AP místa, tvorba 3'-OH • DNA polymeráza - připojení správného nukleotidu - Polp u eukaryot, Poli u prokaryot • DNA ligáza - spojení řetězce • zvýšené riziko kolorektálních nádorů u mutací Pol(3, DNA glykosylázy deaminace C / GCTUATCC lWiTiiľ C G A G T A G G Uracil DNA U ' *■ glykosyláza G C T A T C C AP místo Q Q j1 j g C G A G T A G G AP endonukleáza lnt mezera G C T A T C C "fffii^iir CGAGTAGG DNA polymeráza DNA ligáza opravená DNA GCTCATCC CGAGTAGG https://www.studybluexom/notes/note/n/cha Excizní opravy DNA Nukleotidová excizní oprava (NER) • oprava rozsáhlejšího poškození DNA, které mění a deformuje dvoušroubovici DNA • adukty bází, UV fotoprodukty Bakterie • rozeznání poškozeného místa UvrAB • vyštěpení poškozeného místa UvrBC • uvolnění vyštěpeného úseku UvrD • dosyntetizování chybějící DNA Poli • spojení řetězce LigA Tymidinový dimer 5' M I I lili 3' y 1 1 1 1 1 1......5' UvrA „ . . UvrB Rozpoznaní UvrB UvrC Vyštěpení 5' j | | i | | i i i i | j 3' y » ' ' ' ' ' ■ ' ' ' ' ' y Ligace ^ LigA HO PO, 5' i i i i i i i i i i i' *- 3' y........I I I I y Syntéza DNA f po,y°N*áza , V Odstranění UvrD Člověk • rozeznání poškozeného místa • odvinutí DNA • vyštěpení poškozeného místa • dosyntetizování chybějící DNA • spojení řetězce XPA, XPC, XPE; CSA, CSB XPB, XPD XPF, XPG Pol6/£ DNA ligáza I https://en.wikipedia.org/wiki/Nucleotide_excision_repair#/media/File:A_schematic_representatio Excizní opravy DNA • deficity v NER mechanismech geneticky podmiňují některé syndromy Xerodema pigmentosum - autosomálně recesivní choroba, nejčastěji deficit XPA, XPC - extrémní citlivost k slunečnímu záření - > 1000 x zvýšeno riziko vzniku kožních nádorů Cockaynův syndrom - autosomálně recesivní choroba, deficit CSA, CSB - fotosenzitivita, trpaslictví, retinitis pigmentosa http://www.schumacher-lab.cecad.uni-koeln.de/ Excizní opravy DNA Oprava chybného párování (mismatch repair) • frekvence chyb při syntéze DNA replikace 1:100.000 + proofreading 1:10.000.000 + opravy 1 : 1.000.000.000 E. coli • Dam metyláza metyluje A v sekvenci GATC • těsně po replikaci hemimetylovaný stav • rozpoznání chybného nukleotidu (MutS) • navázání opravných enzymů (MutL, MutH) • MutH štěpí řetězec s nemetylovanou GATC • exonukleáza s helikázou a SSB proteiny odstra ňuje naštěpený řetězec až k chybnému nt • syntéza DNA podle původního řetězce (Pol3) • spojení řetězce (DNA ligáza) • opravný systém používán i u eukaryot a člověka, mutace v opravných genech zvyšují riziko rakoviny http://www.slideshare.net/najmhemato/dna-repair GHj CHj 3'_L____l__5' 5'---31 / MutS, MutL \ f MutH \ CKs S B CHj CHi SÍ\ CH, 5'-\j- "- 3' 5--v •-Li- 3'