Molekulární biologie pro informatiky - 8 Molekulární mechanismy signalizace Signální molekuly Signál • faktor, kterým se zprostředkovává a předává nějaká informace • extracelulární - zdroj mimo buňku, ligand reagující s buňkou pomocí receptoru • intracelulární - zdroj uvnitř buňky Extracelulární signály • proteiny, peptidy, aminokyseliny, nukleotidy, lipidy, steroidy, mastné kyseliny, plyny • hormony - odvozené od aminokyselin (adrenalin, thyroxin) - peptidy a proteiny (inzulín, glukagon, oxytocin) - steroidní (testosteron, estrogen, kortizol) - vitamín D, kyselina retinová • cytokiny - interleukiny, interferony - nádorové nekrotické faktory (TNF-a, TNF-p, TNF-y) - růstové faktory (EGF, PDGF, IGF-1, GM-CSF, GHF, NGF) • nervové mediatory (acetylcholin, GABA) • lokální mediatory (histamin, oxid dusnatý) Signály hydrofilní povahy: vazba na membránové receptory, krátkodobá odpověď Signály lipofilní povahy: vazba na intracelulární receptory, dlouhodobá odpověď Extracelulární signalizace Přenos signálu ze zdrojové buňky na receptor buňky cílové 1. endokrinní - zdrojová a cílová buňka vzdáleny, přenos signálu krví (př. hormony) 2. autokrinní- stejná buňka je zdrojová i cílová 3. parakrinní - produkce signálu do tělních tekutin, lokální účinek (př. histamin, NO) 4. dutý spoj - mezi oběma buňkami v těsném kontaktu vytvořena tubulární struktura (př. Ca2+, cAMP) 5. přímý kontakt - ligand i receptor na povrchu buněk v přímého kontaktu (př. FasL) 6. synapse - nervová soustava, vliv na permeabilitu membrán (př. acetylcholin) https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/cell-com 11606/ https://www.alz.org/braintour/synapses_neurotransmitters.asp https://www.studyblue.eom/notes/note/n/chapter-ll-cell-communication/deck/13660625 Signalizace Intracelulární signalizace • přenos signálu uvnitř buňky • vazba signálu na receptor -> enzymatická aktivita v buňce -> převod signálu na cílovou molekulu Odpověď buňky • genová exprese, aktivita metabolických enzymů, konfigurace cytoskeletu, permeabilita membrány, syntéza DNA, indukce apoptózy • přítomnost receptoru a výbava buňky rozhoduje o tom, na který signál bude buňka reagovat • stejný signál může mít různé účinky u různých buněk (např. acetylcholin) • rychlost reakce - změna funkce proteinů (s - min), změna v expresi genů (min - hod) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/14_02.jpg http://27.109.7.67:llll/econtent/cell-communication/principles-part-2.php Signální dráhy První přenašeč signálu: prvotní signál zachycený buňkou Druhé přenašeče signálu: malé molekuly produkované uvnitř buňky po vazbě ligandu na receptor Intracelulární signalizace zahrnuje • přenos signálu a jeho převod do srozumitelné podoby • zesílení původního signálu, případné rozdělení signálu • propojení signálních drah Po přijetí signálu se rovnováha signálních molekul velmi rychle obnovuje. Odpověď buňky zastavena po rozložení nebo inaktivaci signální molekuly. Ztráta senzitivity buněk • dlouhodobé vystavení buněk působení ligandu • změny na úrovni receptoru (i) odstranění receptoru z povrchu buňky (ii) změny receptoru, které snižují jeho afinitu k ligandu či schopnost převodu signálu do nitra buňky OO I 1 Dráha Dráha #1 #2 0 1 Jedna dráha QO9 & c? IXl čD O \ 1 Dráha Dráha #1 #2 Activated adenylyl cyclase 0999990999, 0999999999 ® Not 4) KnnniíiEEnM ^QQQQQQQQ cAMP ©11 i i l li 1 ,QOOOOOOO protein kinase R^P=liU.linr*HMM //J!\W^ OOOOOOOOOO enzyme amplification * t * i i v w 000000000 product http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/14_02.jpg http://www.slideshare.net/mousvi786/hormones-lecture-h02 Intracelulární receptory • receptory steroidních a tyroidních hormonů, vitamínu D, kyseliny retinové, oxidu dusnatého • difúze ligandu cytoplazmatickou membránou -> vazba na receptor -> změna konformace receptoru -> regulace transkripce cílových genů Funkční domény receptoru • doména pro vazbu ligandu - v nepřítomnosti ligandu může být vázán inhibitor • doména pro dimerizaci - nutná pro plnou aktivaci receptoru • aktivační doména - vazba k TFIID, TFIIB • DNA vazebná doména - vazba k regulačním oblastem DNA, motiv dvou zinkových prstů 1. Cytoplazmatické receptory • steroidní hormony, glukokortikoidy, testosteron, ekdyzon, mineralkortikoidy • vazba HSP proteinů (HSP70, 90), které se uvolní po vazbě ligandu • tvorba homodimeru, přechod do jádra, aktivace příslušných genů • př. androgenní receptor https://commons.wikimedia.org/wiki/File: Human_androgen_receptor_and_androgen_binding.svg Intracelulární receptory 1. Cytoplazmatické receptory • dvoustupňová reakce na steroidní hormony 2. jaderné receptory • tyroidní hormony, vit D, kyselina retinová • tvoří heterodimery (RXR) • př. vitamín D - v krvi vázán na DBP protein -jaderný receptor VDR skin skin 7,8-dehydrocholesterol pre-vitamin D3 vitamin D3 target tissues 24-hydroxylase liver 25-hydroxylase kidney 1a-hydroxy!ase calcitroic acid H vznik a uvolnění NO z endotelových buněk -> difúze k buňkám hladké svaloviny -> aktivace guanylátcyklázu -> relaxace svalové buňky aktivované nervové zakončení acetylcholin aktivovaná NO syntáza vazba NO na guanylátcyklázu RYCHLÁ DIFÚZE NO MEMBRÁNAMI endotelová buňka RELAXACE HLADKÉ SVALOVINY NH, i NO - syntáza C=N*H2 -• i 2 NADPH N-H i H-C-H H-C-H i H-C-H i H-C-NH, i 0=C-OH Arginin NH2 C=0 +NO +2NADP l +2 H20 N-H l H-C-H H-C-H i H-C-H i H-C-NH2 i 0=C-OH Citrulin buňky hladké svaloviny http://27.109.7.67:llll/econtent/cell-communication/principles-part-2.php; http://fblt.cz/skripta/x-srdce-a-obeh-krve/2-krevni-obeh/; www.thompson-lab-fzco.com Přehled proteinkináz protein • fosforylace - vazba fosfátové skupiny na AK zbytky v proteinech - změna biochemických vlastností proteinu • jako donor fosfátové skupiny slouží ATP, vznik ADP • tyrosinkinázy - vazba fosfátu na fenolickou skupinu Tyr • serin/treoninkinázy - vazba fosfátu na hydroxylovou skupinu Ser či Thr SERIN / TREONIN KINÁZY 1. proteinkináza A, PKA • cAMP dependentní protein kináza • homodimer, regulační (R) a katalytická (C) doména • R blokují C a váží PKA na určité místo v buňce • po vazbě cAMP na R jsou C uvolněny a mohou fosforylovat cílové proteiny • př. rozklad glykogenu v svalových vláknech, syntéza somatostatinu v D-buňkách ATP H + ADP 0 eo-p-oe 1 o protein S i Ser/ Thr VP I \ / PDE [> cAMP H.O ■ ATP ■>Llť https://commons.wikimedia.org/wiki/File: PKARII.svg chemwiki.ucdavis.edu Přehled proteinkináz 2. proteinkináza G, PKG • cGMP dependentní protein kináza, homodimer • regulační doména: dimerizace, vazba cGMP, blok aktivního místa • katalytická doména: fosforylace, uvolněna po vazbě cGMP • PKG-I v cytoplazmě hladké svaloviny, trombocytů, endotelu, kardiomyocytů • PKG-II vázána k membráně v buňkách ledvin, střevní mukózy, pankreatu 3. proteinkináza C, PKC • monomer v blízkosti plazmalemy, aktivace účinkem DAG, PtdSer a Ca2+ • regulační doména - vazba DAG, PtdSer a Ca2+, blok aktivního místa • katalytická doména - fosforylace, uvolněna po vazbě ligandů k regulační doméně • fosforylace různých proteinů v závislosti na typu buňky a buněčném kompartmentu http://www.highlights-in-neurobiology.com/gallery-the-kinases-pka-pkg-and-pkc/ Přehled proteinkináz Struktura PKA, PKC a PKG je vysoce příbuzná Regulační doména • pseudosubstrát blokující aktivní místo • leucinový zip pro dimerizaci (ne u PKC) • vazebná místa pro ligandy Katalytická doména • aktivní místo enzymu s kinázovou aktivitou • vazba ATP rsgulatory domain PKG NI PKA n . pwudo- nucleoikle i substrate binding sites ! leucine ; PKC ní I liiiin-jin ATP ."DAG PliiSer Ca' + : ■ =,i1e síta site ; I 4. Ca2+/kalmodulin dependentní proteinkináza II (CaMKM) • regulována komplexem Ca2+/kalmodulin, autofosforylace na Thr286 • katalytická doména - fosforylace, vazebná místa pro ATP • regulační doména - pseudosubstrát, vazba monomerů do multimerů • specializované CaMKM - př. kináza lehkého řetězce myozinu 0 CírVcúfnxxíulri AclÁ-a sjlxmil □ Phosphatase http://www.highlights-in-neurobiology.com/gallery-the-kinases-pka-pkg-and-pkc/ http://www.nature.com/nrn/journal/v3/n3/fig_tab/nrn753_F3.html Přehled proteinkináz TYROSIN KINÁZY • kinázová doména SH1 • receptorové - vázané na plazmatickou membránu, součást receptoru • nereceptorové - nejsou součástí receptoru, pouze s nimi asociují, děleny do rodin: 1. proteinkinázy Src-rodiny • SH1; regulační domény SH2, SH3; ukotvení k membráně myristilovou kyselinou přes SH4 • c-Src - inaktivní: fosforylace Tyr-527, vazba SH2, blok SH1 - aktivace: defosforylací či vyvázáním fosfátu na Tyr-527, fosforylace Tyr-416 • asociace s receptory - receptorové tyrosinkinázy, receptory vázané s G-proteiny, adhezní receptory 2. proteinkinázy Jak-rodiny • přímá aktivace receptory pro interferon, Jak/STAT signální dráha 3. proteinkinázy Syk-rodiny http://www.ijbs.com/v08pl385.htm http://www.angelfire.com/sc3/toxchick/molbiocancer/molbiocancerl2.html Přehled proteinkináz MAP-PROTEINKINAZY • proteinkinázy aktivované mitogeny • fosforylace na Ser či Thr nebo současně na Thr a Tyr 1. MAP-kinázakinázakinázy (MAPKKK) • aktivace MAPKK pžes Ser či Thr • př. Raf-proteinkináza přímo aktivovaná Ras proteinem 2. MAP-kinázakinázy (MAPKK) • aktivace MAPK fosforylací Thr a Tyr (Thr-X-Tyr) • př. MAP/ERK-proteinkináza (MEK-proteinkináza) 3. MAP-kinázy (MAPK) • po své aktivaci migrují k cílovým molekulám Signal kinase MKKK Second kinase MAP kinase Response proteins Response Cellular response SERIN / TREONIN KINÁZY • proteinkináza A (PAK) • proteinkináza G (PKG) • proteinkináza C (PKC) • Ca2+/kalmodulin d. proteinkináza II (CaMKM) NERECEPTOROVÉ TYROSIN KINÁZY • proteinkinázy Src-rodiny • proteinkinázy Jak-rodiny • proteinkinázy Syk-rodiny http://www.stylepinner.com/protein-receptor-map/cHJvdGVpbilyZWNIcHRvciltYXA/ Další enzymy signálních drah Adenylátcykláza • ATP -> bisfosfát + cyklický adenosinmonofosfátu (cAMP) Guanylátcykláza • GTP -> bisfosfát + cyklický guanosinmonofosfát (cGMP) Typ 1 - homodimer, receptor pro různé ligandy - extracelulární, transmembránová, kinázová, cyklá-zová doména - př. ANF: atriální natriuretický faktor vyloučení Na+ a vody z ledvin Typ 2 - rozpustný heterodimer, alfa a beta řetězec - aktivace vazbou NO - vazebná (hem), cyklázová doména NHj = 0 "SIf_^ -y m> \ O—P- adenylyl cyclase OH OH -o ATP PPi GTP cGMP Membrane associated guanylyl cyclase -O OH c A MP o Čí*!" 0=P-O OH OH Extracellular region mmimmmmiiawmmmmm Cytoplasm GTP cGMP Soluble guanylyl cyclase Peptide ligand ATP konformační změna receptoru -> otevření kanálu -> pohybu iontů mezi buňkou a okolím -> disociace ligandu z receptoru -> uzavření kanálu ligandy- neurotransmitery, peptidové hormony molekuly procházející kanálem - ionty Na+, K+, Ca2+, Cľ Signalizace na synapsích převod chemických signálů na elektrické excitovaný presynaptický neuron vypouští neurotransmiter, který se váže na receptor spojený s iontovým kanálem otevřeným kanálem proudí ionty, které vyvolají excitaci postsynap-tického neuronu př. receptor pro serotonin - cíl antidepresiv a antipsychotik př. receptor pro GABA (y-aminomáslená kyselina) - hlavní inhibiční neurotransmiter CNS - ovlivňuje chování drogově závislých jedinců molecule Gate o o o o V dosed Q (Ugand)' \ Plasma Ligand-gated membrane ion channel receptor Gate open\^ °0 O Oq https://hodnett-ap.wikispaces.com/Chapter+ll+Cell+Communication http://www2.cedarcrest.edu/academic/bio/hale/bioT_EID/lectures/tetanus-neuron.html Katalytické receptory TYROSINPROTEINKINÁZOVÉ RECEPTORY • tyrosinproteinkinázová aktivita regulovaná ligandy • společné strukturní rysy • extracelulární doména - N-konec, glykosylována - vazba ligandu - určuje typ signálu, na který bude buňka citlivá • transmembránová doména - krátká, hydrofobní, a-šroubovice • cytoplazmatická doména - C-konec, tyrosinproteinkinázová aktivita - určuje typ signálni dráhy a tím i buněčnou odpověď • kolem 50 receptoru • 14 rodin podle motivu v extraceluárních doménách (U KINASE -V IG-LIKE O GLYCINE RICH FIBRONECTIN III O LEUCINE RICH 0 CADHERIN CO CYSTEINE RICH EGFLIKE CKS> ACID BOX http://themedicalbiochemistrypage.org/signal-transduction. php#receptors Katalytické receptory Aktivace tyrosinproteinkinázových receptoru • vazba ligandu do vazebného místa v extracelulární doméně • změna konformace a dimerizace receptoru • stimulace tyrosinproteinkinázové aktivity, autofosforylace • P-Tyr jsou vazebnými místy pro intracelulární proteiny, které předávají signál dál Signal-molecule u-hellx in the bindin9 si,e Activated tyrosine-kinase receptor (phosphorylated dimer) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/CB14.html http://www.uic.edu/classes/bios/biosl00/mike/spring2003/lect07.htm Katalytické receptory RECEPTORY S PRIDRUŽENOU TYROSINPROTEINKINÁZOVOU AKTIVITOU • nemají kinázovou doménu, po vazbě ligandu dimenzují, aktivují nereceptorové tyrosinproteinkinázy • imunoglobulínové receptory - BCR, TCR, vazba antigénu - asociace s kinázami Src- a Syk-rodin • receptory pro cytokiny - př. Epo, GM-CSF, HGF, IL2-10, interferony antigén Blk, Fyn, or Lyn Syk Receptory asociované s proteinkinázami Src-rodiny • po dimerizaci receptoru aktivována Src-kináza • na její P-Tyr-416 se váži adaptorové molekuly, které přenáší signál dál Receptory asociované s proteinkinázami Jak-rodiny • po dimerizaci receptoru aktivována Jak-kináza • fosforylace receptoru • vazba a fosforylace STAT http://www.ijbs.com/v08pl385.htrn http://www.slideshare.net/many87/micr-304-s2010-lecture-10-b-ly-plasma-memppt www.europeanmedical.info/haemolytic-anaemia/erythropoietin-and-the-erythropoietin-receptor.html O Tyr-527 Tyr-416 P JAK2 <- JAK2 P -> P JAK2 P P P STAT P P STAT P JAK2 P P P Pe SH2 doména • Src Homology 2 • strukturní doména (cca 100 AK) u většiny eukaryotických organizmů • vazba na fosforylovaný tyrosin v sekvenci 3-6 aminokyselin • po spojení s P-Tyr se mění konformace a aktivita proteinu s SH2 * podíl na interakcích signálních molekul - různé SH2, které se liší rozeznávanými sekvencemi - spojuje katalytické receptory s např. FLC, G proteiny, transkripčními faktory - součástí enzymů (Src, Jak, Lek, Fyn, Syk, PLCG, PI3K) adaptorových molekul (Grb2) transkripčních faktorů (STAT) regulátorů signalizace (SOCS) • signální dráha přes proteiny Ras = příklad zapojení SH2 domény do signalizací Enzymes Adaptors Docking Proteins Transcription Factors Stat Cytoskeletal Proteins Tensin Inhibitory Factors Sap Btk PH - TH — SH3 SH2 - Y KINASE DNA Binding -SH2- SH2 SH2~l— PTB https://commons.wikimedia.org/wiki/File: llkkA_SH2_domain.png http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=domains-sh2 Rodina proteinů Ras • monomerní GTPázy se schopnost vázat GDP/GTP • po prenylaci CAAX boxu vazba k plazmatické membráně • aktivace GEF faktorem, který uvolňuje GDP • Ras váže GTP, aktivuje se a přenášejí signál na své efektory • inaktivaci zajišťuje GAP protein, který podporuje hydrolýzu GTP • nadrodina proteinů Ras - rodiny Ras (růst a diferenciace buněk) Rho (morfologie a pohyb buněk) Rab a Arf (transport měchýřků) Ran (jaderný transport) Signalizace přes Grb2-Sos • Grb2 se přes SH2 doménu spojuje s aktivovanými tyrosinproteinkinázovými receptory SH3 doménu konstitutivně váže k proteinu Sos • Sos funguje jako GEF a zajišťuje aktivaci Ras INACTIVE ACTIVE Receptor Ras-GTP (active) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/CB14.html Figure 15-54. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Rodina proteinů Ras Aktivovaný Ras-GTP váže a aktivuje své efektory, hlavním efektorem proteinů Ras je kináza Raf MAPK dráha zahájená aktivací Raf • Raf - Ser/Thr MAPKKK - v inaktivním stavu udržuje faktor 14-3-3 konformaci blokující katalytické místo - vazba Ras-GTP indukuje disociaci 14-3-3 Vazba Ras-GTP Flexibilní oblast Proteinkinázová doména 14-3-3 dimer / C Skryté aktivní místo Blok autoinhibiční doménou • MAPKK-MEK • MAPK - ERK, transport do jádra, aktivace transkripčních faktorů • transkripční faktory se váží na SRE (sérum response elements) a indukují transkripci specifických genů (SRF, sérum response factor) • přenos signálů od mitogenů • dominantní při signalizaci určující růst, vývoj a diferenciaci buněk http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/CB14.html https://commons.wikimedia.Org/wiki/File:C-Raf-architecture.png Rodina proteinů Ras GEF faktory aktivující Ras proteiny - Sos: signál od proteinkinázových receptorů přes Grb2 - Ras-GRP: signál od fosfolipázy C přes DAG - Ras-GRF: signál od Ca2+iontového kanálu přes kalmodulin Efektory proteinů Ras Transkripce Proliferace (PDKl V @> s X JDM^I (TSCl) (WC)( (g) 1 <ČD£42)(RÁa) (^) (DAG) (arT) I \ Endocytóza ieb; JL • Přežívání buněk • Růst buněk • Buněčná migrace • Proliferace • Transkripce Cytoskelet Buněčná migrace • Ca2+ signalizace Nádorová onemocnění • stále aktivní Ras-GTP (blok hydrolýzy GTP, mutace GAP proteinů) • H-Ras, K-Ras a N-Ras nejčastější onkogeny nádorových onemocnění (u 20 - 30 % nádorů) • inhibitory Ras proteinů předmětem protinádorové léčby http://www.naturexom/nrc/journal/vll/nll/fig_tab/nrc3151_Fl.html Přímá aktivace transkripčních faktorů Signální dráha Jak/STAT • Jak konstitutivně asociuje s receptorem • STATjsou transkripční faktory s SH2 doménou, translokace cytoplazma -> jádro • vazba cytokinu -> dimerizace receptoru -> fosforylace Jak, fosforylace receptoru -> vazba a aktivace STAT -> dimerizuje STAT -> translokace do jádra -> aktivace cílových genů • negativní regulace dráhy - fosfatáza SHP1: vazba na P-Tyr receptoru (SH2), defosforylace Jak - proteiny SOCS: vazba na P-Tyr receptoru (SH2), blok struktury vazba ubikvitin ligázy, degradace Jak v proteazomu Tyrosine phosphorylation of http://www.nature.com/nrm/journal/v3/n9/fig_tab/nrm909_Fl.htm http://www.sp.uconn.edu/ntc02001/MCB3201/Study%20Guide/%5BVII%5D%20Signal%20Transduction.ppt Přímá aktivace transkripčních faktorů Signalizace TGFß (Transforming Growth Factor ß) Secreted TGFß precursor H-50-375 aa- f-110-140 aa»] I M OO OO )-coo ŠH *Mature domain Proteolytic cleavage Binding by LTBP 0 Pro-domain Latent complex s i O-O O-O O-O O-O O-O O-O Pro-domain J-s-.s Conformational change or proteolysis of LTBP; release of mature TGF|5 Mature form (homo- or hetero dimer) H3N-f 1 oo oo oo )-COO • tři izoformy TGFpl-3 • prekurzor sekretovaný do extracelu-lárního prostoru • odštěpení pro-domény, vazba na LTBP protein -> latentní komplex • po aktivaci uvolněn zralý dimer TGF(3 *H3N-(I O-O O-O O-O )-cocr • tři typy receptoru Rl a R2 - transmembránové dimery - Ser/Thr kinázovou aktivita v cytosolické doméně R3 - vazba a koncentrace TGF(3 blízko povrchu buněk • vazba TGF(3 na R2 -> přitažení a aktivace Rl -> fosforylace Smad3 -> dimerizace Smad3 a tvorba komplexu se Smad4 a Importinem p -> translokace do jádra -> uvolnění Importinem p -> Smad3/ /Smad4 váže transkripční faktor TFE3 a reguluje trasnkripci genů R!" 6r n\ CP Cytosol SmadSe^ (^^SmadS-P Smad4 #lmp-ß 3-bp spacer http://www.sp.uconn.edu/ntc02001/MCB3201/Study%20Guide/%5BVII%5D%20Signal%20Transduction.ppt Sekundární přenašeče NH, nízká molekulová hmotnost dobře rozpustné krátký poločas rozpadu intracelulární signály přenos, amplifikace a rozdělení signálu z receptoru po přijetí signálu aktivovány enzymy zodpovědné za jejich tvorbu jejich koncentrace v buňce stoupá a klesá v závislosti na přítomnosti mimobuněčného signálu vyvolávají rychlou změnu aktivity enzymů nebo jiných proteinů O—CH, CO ,0. 0=P-O OH I O N O—CH, 0=P-O OH I O OPO. CH3 — (CH2) — C — O—CH2 CH3 — (CH2) —C—O—CH II O 3', 5'-cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) Aktivuje proteinkinázu A (PKA) 3', 5'-cyklický guanosinmonofosfát (cGMP) Aktivuje proteinkinázu G (PKG) lnositol-l,4,5-trisfosfát (lns(l,4,5)P3) Otevírá Ca2+ kanály ER 1,2-diacylglycerol (DAG) Aktivuje proteinkinázu C (PKC) Receptory vázané na G-protein G-proteiny (trimerní) - m Hormone Receptor G protein Enzyme 2nd (1st messenger) messenger Přenos signálu z receptoru na producenta sekundárních přenašečů Vazba hormonu na receptor Adenylate cyclase I Extracellular fluid Receptor T GDP GTP Inactive protein kinase Receptor G-protein Adenlyátcykláza aktivuje aktivuje měníATP G-protein adenlyátcyklázu nacAMP Active protein kinase Přenos signálu na cílovou strukturu cAM P aktivuje proteinkinázu A Podjednotka a - vazebné místo pro GDP/GTP, GTPázová aktivita Podjednotky py - ukotvení G-proteinu v plazmatické membráně Základní stav • asociace apy podjednotek, GDP na podjednotce a Aktivace • vazba ligandu na receptor vede k výměně GDP za GTP (GEF faktor) • disociace a od py • a a py regulují aktivitu specifických cílových proteinů Inaktivace • po hydrolýze GTP na GDP (GAP protein) návrat do trimerního stavu ligand li-ctc-rotrinnrj-ric G-f>mlflin http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio211/chapl6/chapl6.htm https://courses.washington.edu/conj/bess/gpcr/gpcr.htm 91189549944794 17945994 ^974 Receptory vázané na G-protein Gas a aktivace adenylátcyklázy, Ca2+ kanálů Gai a inaktivace adenylátcyklázy, aktivace fosfolipázy C a cGMP fosfodiesterázy ßv aktivace K+ kanálů a fosfolipázy C Gaq a aktivace fosfolipázy C Gal2 a aktivace Rho Stimulatory [Epinephrine hormone vysoká koncentrace cAMP v epitelu střeva -> propustnost iontových kanálů -> únik vody a iontů do lumen střeva -> prudké průjmy Epithelial cell Mucus http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio211/chapl6/chapl6.htm Nitrobuněčné signální dráhy Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) • koncentrace závislá na aktivitě: adenylátcyklázy cAMP fosfodiesterázy • přenos signálu z membrány k proteinům cytosolu nebo jádra ---N. NH, O II O—P —O—P —O—P—O—CH3 „ I I I ' '° O" o- o- W_2 OH OH Adenosin 5'-trifosfát (ATP) Adenylát-cykláza 5' O—CH, o 5' MH;, V cAMP fosfodiesteráza O—P—O —CH2 „ I -° O OH 0=P- I O" 3', 5'-cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) w OH OH Adenosin 5'- monofosfát (AMP) • vazba na regulační doménu PKA -> uvolnění katalytické domény -> fosforylace cílových substrátů i) transkripční faktor CREB: aktivace příslušných genů po vazbě k sekvencím CRE ii) receptory steroidních hormonů iii) kináza lehkého řetězce myozinu (MLCK) v buňkách hladké svaloviny Lehké řetězce https://www.studyblue.eom/notes/note/n/2-section-6-atp-synthesis-and-atp-synth http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/CB23.html Nitrobuněčné signální dráhy Cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) • objeven při studiu metabolismu glykogenu (Sutherland, 1958) • glykogen je zásobárnou glukózy v lidském těle • při stresu se do krve produkuje adrenalin, který stimuluje svalové a jaterní buňky k uvolnění a štěpení glykogenu 20~50nm o:Glucose H OH K ÍJH j3 CH£H CHíOH ĚCH2 H/T— <\h H/^M1 CA-*\í ß/^~\F ■Ajk p-Ap pÁj^ ffiivjk yJs^ p H OH H OH Mechanismus • vazba adrenalinu na (3-adrenergní receptory svalových buněk • aktivace G-proteinu -> aktivace adenylátcyk-lázy -> zvýšení hladiny cAMP -> aktivace PKA • fosforylace/aktivace fosforylázové kinázy • fosforylace/aktivace glykogenové fosforylázy • štěpení glykogenu na glukóza-l-fosfát, která je po defosforylaci uvolněna do krve • PKA zároveň fosforyluje/inaktivuje glykogen syntázu I nactive Fosforylázová kináza Katalytická podjednotka PKA Glykogenová fosforyláza I Glycogen iß* I Glucose 1-Phosphate | Active Glykogen syntáza Namrota Heda http://namrataheda.blogspotxz/2013/02/si http://www.glico.co.jp/en/material/bioglycogen/ Signalizace přes inzulínový receptor Inzulín - heterodimer, B buňky Langerhansových ostrůvků slinivky břišní - snižuje hladinu glukózy v krvi, podporuje její využití buňkami a přeměnu na glykogen Inzulínový receptor - IR, tyrosinproteinkinázový receptor rodiny 2, heteroteramer Signální dráha • vazba inzulínu -> autofosforylace/aktivace IR -> fosforylace/aktivace IRS-1 • na IRS-1 se přes SH2 domény váží i) Grb2-Sos Ras-Raf-MAPK dráha ii) PI(3)K -> tvorba PIP3 -> aktivace Akt - translokace glukózového transportéru GLUT4 k membráně - aktivace glykogen syntázy http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/14_23.jpg http://www.123rf.com/photo_13207592_human-insulin-stylized-chemical-structure.html Nitrobuněčné signální dráhy Cyklický guanosinmonofosfát (cGMP) • koncentrace závislá na aktivitě guanylátcyklázy a cGMP fosfodiesterázy • aktivuje PKG - stimulace iontových kanálů (Ca2+, Na+) - uvolnění hladké svaloviny, dilatace tepen, sekrece Na+ a vody v trávicí soustavě • mění propustnost iontových kanálů v tyčinkách oční sítnice - tma: guanylátcykláza tvoří cGMP, iontové kanály otevřeny - světlo: absorpce fotonu -> aktivace rodopsinu -> aktivace G-proteinu -> aktivace fosfodiesterázy -> hydrolýza cGMP -> zavření iontových kanálů -> hyperpolarizace membrány -> vizuální signál Dark nucleus IB) GMP cGMP Ca' cGMP rod cell membrane Ca'* #* cGMP_-T^3) Na+ •£aM) *• am 4Na* K+Ca2 rod cell membrane Ca2+ Na+ _4Na+ ~K+ Ca2+ Rod Rod^g i outer segment 1 cGMP p i ## * T Rod inner 4 segment Light http://namrataheda.blogspotxz/2013/02/sign http://www.glico.co.jp/en/material/bioglycogen/ Nitrobuněčné signální dráhy Dráha Ca2+ • rozdílná koncentrace v cytoplazmě (10"7 M) a mimobuněčné tekutině (10"3 M) • buňka jej nepřijímá, aktivně vyčerpává, váže do organel • zvýšení koncentrace v cytoplazmě aktivuje nitrobuněčný signální mechanismus 1. depolarizace membrán akčním potenciálem 2. fosfolipáza C štěpí PIP2, vzniklý lns(l,4,5)P3 otvírá Ca2+ kanál endoplazmatického retikula • cílové proteiny - troponin C v buňkách kosterního svalstva (svalová kontrakce) - kalmodulin Ca2+ signální vlna v oplozeném vajíčku http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/CB14.html https://www.studyblue.eom/notes/note/n/chapter-9-muscles/deck/5997793 Nitrobuněčné signální dráhy Kalmodulin • dvě globulární domény (vazba Ca2+) spojené flexibilní oblastí (vazba k různým substrátům) • vazba čtyř iontů Ca2+ mění jeho konformaci, vyšší afinita k proteinům, které mění svoji aktivitu • důležitou cílovou molekulou je CaMKM • úloha v metabolismu (aktivace fosforylázové kinázy), kontrakci hladké svaloviny (aktivace MLCK), expresi genů (CREB), sekreci neurotransmiterů, zánětu, pohybu buněk, apoptóze Interakce cAMP a Ca2+ drah • komplex Ca2+/kalmodulin může vázat a regulovat aktivitu adenylátcyklázy a fosfodiesterázy • PKA může fosforylovat některé kanály určující obsah Ca2+ v cytosolu • CaMKM může být fosforylována PKA • PKA a CaMKM často fosforylují aminokyseliny stejného proteinu (např. CREB) http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-14/CB14.html Nitrobuněčné signální dráhy Dráha inositolových fosfolipidů PLC PIP2 -► DAG + lns(l,4,5)P3 fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát diacylglycerol inositol-l,4,5-trisfosfát • PLCp aktivována G-proteinem z rodiny Gaq • PLCy aktivována po vazbě na tyrosinproteinkinázový receptor (SH2 doména) • lns(l,4,5)P3 uvolňuje Ca2+z buněčných zásob • DAG aktivuje PKC, PI3K https://droualbJaculty.mjc.ed^ Oxid dusnatý při vazodilataci - mechanismus účinku Nervová zakončení signalizující uvolnění hladké svaloviny uvolňují acetylcholin Buňky endotelu • vazba acetylcholinu na receptor vázaný na G-protein, aktivace Gaq • aktivace PLC(3, produkce lns(l,4,5)P3 • uvolnění Ca2+z endoplazmatického retikula, tvorba komplexu Ca2+/kalmodulin • aktivace NO syntázy, produkce NO, který difunduje k buňkám hladké svaloviny Buňky hladké svaloviny • prostup NO membránou, aktivace rozpustné guanylátcyklázy, produkce cGMP • aktivace PKG, fosforylace řady svalových proteinů, relaxace svalové buňky vazodilatace Lumen cévy Acetylcholine iílOj Acetylcholine D Phospholipase GPCR C —*—>/GTP NO V» .........-ÍNÓ>-. receptor ■■ Protein —^>CGMPH kinase G Oj Relaxace svalové buňky Buňky endotelu Buňky hladké svaloviny Buňky hladké svaloviny https://www.studyblue.eom/notes/note/n/unit-3/deck/4896946 http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=Vasodilatateurs&lang=4 Utlumení signálních drah • snížení hladiny hormonů, defosforylace složek signálních drah, degradace sekundárních přenašečů • nitrobuněčné negativní regulátory (SOCS) • odstranění receptoru z povrchu buňky endocytózou - př. receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR) je po vazbě EGF pohlcen do klatrinových váčků, transportován do lysozomů a degradován Degradace v endolyzozomech • přítomnost mutantních složek signálních drah - př. dominantně negativní mutace receptoru pro fibroblastový růstový faktor (FGF) pair, become with normal receptors, activated, and but the heterodimer cannot transmit signal transmit the signal • sekrece proteinů, které vychytávají hormony - tyto proteiny dokáží vázat hormon, ale nejsou schopny aktivovat nitrobuněčnou signalizaci - př. kontrola resorpce kostí http://www.wormbook.org/chapters/wwwjntracellulartrafficking/intracellulartrafficking Tvorba kostí u savců • osteoklasty: odbourávání kostní hmoty, receptor RANK • osteoblasty: tvorba mezibuněčné hmoty produkce ligandu RANKL a osteoprotegerinu (OPG) • osteocyty: klidová forma osteoblastu • vazba RANKL na RANK aktivuje diferenciaci osteoklastů, resorpci kostí • útlum resorpce kosti přes sekreci OPG, který brání vazbě RANKL na RANK Lakuna Lamely Osteocyt Osteoklast Kanálky Osteoblast poruchy tvorby kostí u člověka i) osteoporóza: přílišná resorpce kosti, nedostatečná denzita kostní tkáně, zvýšená křehkost kostí ii) osteopetróza: abnormálně nízká resorpce kosti, zvýšená denzita kostní tkáně lámání kostí, poškození kostní dřeně Zralý Osteoklast Normální stav Makrofág Nezralý Osteoklast Aktivovaný Osteoklast Osteoblast Mm^F Osteocyte Tvorba kosti Resorpce kosti http://www.nature.eom/nrg/journal/vl3/n8/figJ:ab/nrg3228_F2.html https://www.studyblue.eom/notes/note/n/lc-osseous-tissue-images/deck/3142177 Zvídavé otázky Buňka dokáže rychle odpovědět na extracelulární signál pokud: A. buňka nevyžaduje receptor pro signální molekulu B. odpověď nevyžaduje, aby se změnily proteiny v cílové buňce C. odpověď nevyžaduje, aby se spustila exprese genů či syntéza proteinů Co potřebuje cílová buňka, aby mohla odpovědět na extracelulární signální molekulu? A. přístup k signální molekule B. přítomnost odpovídajícího receptoru C. odpovídající intracelulární signální dráhu D. vše z uvedeného Po vazbě ligandu se tyrosinproteinkinázové receptory aktivují dimerizací, což umožňuje: A. každý polypeptidový řetězec dimeru fosforyluje sám sebe na tyrosinu cytoplazmatické domény B. každý polypeptidový řetězec dimeru fosforyluje druhý řetězec na tyrosinu cytoplazmatické domény C. internalizaci receptoru, což umožní fosforylaci a aktivaci různých intracelulárních signálních proteinů Jaká je funkce diacylglycerolu (DAG) v dráze inositolových fosfolipidů? A. Aktivuje fosfolipázu C (PLC) B. Sám o sobě váže a aktivuje proteinkinázu C (PKC) C. Spolu s Ca2+váže PKC z cytosolu k plazmatické membráně a aktivuje ji D. Váže se k Ca2+ kanálům, otevírá je a umožňuje extracelulárními Ca2+ dostat se do buňky Mutantní Ras protein, který se často vyskytuje u nádorů, nemůže hydrolyzovat GTP na GDP a proto: A. se nemůže zapnout B. se nemůže vypnout C. nemůže být degradován D. je schopný přímo aktivovat MAPK dráhu Zvídavé otázky Každý extracelulární signál indukuje podobnou odpověďv rozdílných cílových buňkách (ANO / NE) Jaká je funkce inositol-l,4,5-trisfosfátu (lns(l,4,5)P3 )v dráze inositolových fosfolipidů? A. vytváří díry do membrány endoplazmatického retikula (ER), čímž vypouští Ca2+ z ER do cytoplazmy B. váže se k Ca2+ kanálům v membráně ER, čímž je otevírá a vypouští Ca2+ z ER do cytoplazmy C. Přímo aktivuje proteinkinázu C (PKC) D. Aktivuje fosfolipázu C (PLC) Když je adenylát cykláza aktivována přes receptor vázaný na G-protein, tak: A. mění AMP na cAMP B. mění ADP na cAMP C. mění ATP na cAMP D. mění cAMP na AMP Protein Ras je aktivován Ras-aktivačním proteinem, který: A. způsobuje vazbu Ras ke G-proteinu B. fosforyluje Ras C. defosforyluje Ras D. vyvolává u Ras výměnu GDP za GTP Paralelní intracelulární signální dráhy mohou interagovat mimojiné proto, že proteinkinázy z jedné dráhy mohou fosforylovat a regulovat proteiny z jiných drah (ANO / NE) Která z následujících molekul není malou intracelulární sigální molekulou (sekundárním přenašečem)? A. cAMP B. Fosfolipáza C C. lnositol-l,4,5-trisfosfát D. Diacylglycerol