Molekulární biologie
11. Apoptóza a imunita
Osnova
1. Apoptoza
2. Vývoj a aktivace T- a B-lymfocytů
3. Imunoglobuliny, exprese BCR a TCR
Hlavní zdroje:
S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4
Masarykova Universita Brno
ISBN 80-902562
M. Muller, Biology of Cells and Organisms
University of Illinios, Chicago
http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/summer2010/lecturesm10.htm
Wikipedia
Apoptóza
programovaná buněčná smrt
Apoptóza
- koncept apoptozy od 1950s
- intenzivně zkoumána od 1990s
- poruchy apoptozy hrají roli v různých
nemocech, zejm. rakovině
Počet článku zkoumajících apoptozu (PubMed)
Excesivní apoptóza
např. dystrofie
Omezená apoptóza
např. rakovina
Dystrofie - degenerace tkáně z důvodu nemoci nebo špatné výživy
Apoptóza - buněčná sebevražda
- nezbytná pro vývoj a homeostázi organismu
- pouze u mnohobuněčných organismů
- přísně regulovaný proces (na rozdíl od nekrózy)
- buněčný stres nebo signalizace od jiných buněk stimuluje
pro-apoptotické signální dráhy
- tyto dráhy kaskádovitě aktivují proteázy zvané "kaspázy"
- kaspázy způsobují mitochondriální dysfunkci
- apoptotická buňka vykazuje charakteristické změny morfologie
Homeostaza - stálost vnitřního prostředí
Buněčný stres/
Signalizace
pro-apoptotické
signální dráhy
Kaspázy
APOPTOZA
Charakteristické morfologické znaky apoptozy
1. Blebbing
- nepravidelné záhyby cytoplazmatické membrány
- smršťování buňky (shrinkage)
- vznikají odpojení cytoskeletu od membrány
- degradace vnitřní struktury buňky
- vznik apoptotických tělísek
2. Fragmentace jádra
- Kaspáza 3 aktivuje endogenní endonukleázu - enzym CAD (Caspase-Activated DNase)
- štěpí chromatinovou DNA na fragmenty o délce cca 180bp
- na elektroforetickém gelu lze pozorovat 180bp fragmenty DNA a jejich násobky (360, 540...)
- 180bp je zhruba délka rozestupu histonů na DNA
místa štěpení CAD endonukleázou
CAD
Pyknóza - ireverzibilní kondenzace chromatinu
žebříček
Kdy probíhá apoptóza
Příklady:
- zánik nadbytečných buněk v prenatálním období (u embrya, u plodu)
- orgány se zakládají jako shluky buněk
- duté orgány vznikají tak, že vnitřní buňky zaniknou apoptózou (A)
- diferenciace lidských prstů (B)
- zánik buněk ve tkáních - např. zánik červených krvinek po přibližně 80 dnech
- poškození DNA, které již neumí buňka opravit (D)
researchgate.net
Apoptóza vs. Nekróza
https://www.pinterest.com/spanglyal/cancer-cell-mapping/
Apoptóza může být indukována dvěma drahami
1. Vnitřní dráha (intrinsic pathway; mitochondriální)
- z důvodu buněčného stresu nebo DNA damage
- uvolnění proteinů (hl. Cytochrom C) z prostoru na membráně mitochondrií
2. Vnější dráha (extrinsic pathway)
- z důvodu vnější signalizace od ostatních buněk
- extracelulární ligandy (hl. TNF-α a Fas) se váží
na tzv. death-receptory na povrchu buněk
- TNF-α produkují aktivované makrofágy
- Fas ligand produkují TC lymfocyty
Metody detekce apoptózy
např. při testování léčiv in vitro
Nic
Lék na
leukemii
Zdravé
krvinky
Leukemické
krvinky
1. Barvení buněk trypanovou modří
- proniká a barví pouze mrtvé buňky
- počítání ve světelném mikroskopu na sklíčku s mřížkou
- nerozliší mezi apoptotickou a nekrotickou buňkou
2. Flow cytometrie
Technika pro analýzu velkého množství buněk.
Na buňkách je možné rozlišit
- velikost (forward scatter)
- tvar (granularitu; side scatter)
- fluorescenční barvičku (DNA interkalator; obdoba trypanové modři)
- expresi povrchových proteinů (protilátka proti povrchovým antigenům konjugovaná
fluorochromem)
- expresi intracelulárních proteinů (buňky nutno usmrtit a permeabilizovat membránu)
Forward scatter
velikost
Sidescatter-granularita
2. Flow cytometrie
Detekce buněčné smrti pomocí DNA interkalátoru (např. propidium jodid PI; nebo
DAPI)
- PI je fluorescenční barvička, vážící se na DNA
- podobně jako trypanová modř proniká a barví pouze mrtvé buňky
Histogram barvení propidium jodidem
interkalace – vmezeření. I. do DNA – vmezeření určité látky mezi obě vlákna DNA
pozitivní signál, buňky obarvené na PI = mrtvé
negativní signál, buňky neobarvené na PI = živé
Apoptosis /
Necrosis
Annexin V (FITC)
Propidiumiodide(PerCP-Cy5)
Viable cells Early apoptotic
cells
Late apoptotoic
or necrotic cells
Annexin V
FITC staining
fosfolipid fosfatidylserin
2. Flow cytometrie
osa x: intenzita fluorescenčního signálu v kanálu FITC (buňky pozitivní na Annexin)
osa y: intenzita fluorescenčního signálu v kanálu PerCP-Cy5 (buňky pozitivní na Propidium jodid)
Annexin+... časná apoptoza
PI+... pozdní apoptoza
3. Western blotting
- izolace celkového proteinu z buněk a rozdělení proteinů na polyakrylamidové gelu podle své velikosti.
- inkubace s protilátkou umožní zjistit, zda je daný protein ve vzorku přítomen a v jakém množství (oproti
jinému vzorku na téže membráně - semikvantitativní metoda)
- příklady markerů apoptózy:
- proapoptotický protein z rodiny Bcl-2: BIM
- štěpení (pro)kaspázy
- štěpený protein PARP
Živébuňky
Apoptotickébuňky
Imunitní systém
Imunitní systém
Existuje fyzická, chemická a buněčná obrana proti invazi bakterií a virů
1. linie obrany - fyzická a chemická
a) kůže: vrstva mrtvých buněk - suchá a s nízkým pH
b) sliznice: pokryty lysozymem - chemický rozklad bakterií
c) cilie (řasinky): výběžky buněk, působí jako filtr a aktivně odstraňují patogeny
wikipedia
Hematopoéza (krvetvorba)
Imunitní systém
2. linie obrany - nespecifická imunitní odpověď
- obecná odpověď na infekci patogenem
- je vyvolán zánět
Granulocyty
a) Neutrofil - fagocytuje bakterie a sekretuje lysozym který degraduje bakteriální stěny
b) Eosinofil - vylučuje enzymy, které zabíjí parazitické červy
c) Bazofil - vylučuje histamin pro podporu zánětu
d) Mastocyt (mast cell; žírná buňka)
- vylučuje signály pro snížení průtoku krve v místě poranění a histamin
- signály pro zvýšení průtoku krve a propustnosti kapilár v okolí poranění, aby se fagocyty
dostaly do místa poranění
e) Makrofágy - fagocyty (big eaters) - fagocytují vše
- obsahují MHC (major histocompatibility complex) , který vystavuje antigen
- sekrece cytokinů, které přitahují další makrofágy a neutrofily
- zvyšují teplotu
- v krvi kolují ve formě monocytů
Antigen: částice rozeznávaná protilátkou, v imunologii se jedná o cizí patogen
Protilátka: částice, která specificky rozeznává antigen a je rozeznávána lymfocyty
MHC-molekuly (proteiny)
- Major histocompatibility complex (hlavní histokompatibilní komplex)
- u lidí zvaný též HLA-komplex (human leukocyte antigen)
- soubor povrchových proteinů - posttranslačně glykozylované proteiny
Syntéza MHC
- během syntézy zachycují peptidy a fragmenty vzniklé odbouráváním cizorodých proteinů (antigenů) a
zanořují je do povrchu buňky
- buňka se stává APC (buňkou nabízející antigen)
- antigen je rozeznáván TCR-receptorem T-lymfocytů
Typy MHC
1. MHC I (první třídy)
- vážou peptidy získané po zničení virem infikované či jinak vadné tělní buňky
- jsou rozeznávány TC -lymfocyty, které se aktivují k usmrcení podobných buněk
2. MHC II (druhé třídy)
- vážou peptidové fragmenty z patogenů fagocytovaných APC buňkou
- jsou rozeznávány pouze TH-lymfocyty
Zánět
- patogeny vstupují do místa poranění
- krevní destičky vylučují srážlivé faktory
(1) Makrofágy, (2) Neutrofily, (3) Mastocyty
- makrofágy a buňky poraněné tkáně vylučují cytokiny, které přivolávají pomoc
- změny ve stěnách kapilár umožňují průchod bílých krvinek a tkáňového moku
- mastocyty indukují vazokonstrikci poraněných cév a vazodilataci okolních cév
- zvýšení teploty
Tkáňový mok (interstitial fluid): mezibuněčná tekutina v těle mnohobuněčných živočichů. Hlavní složka mimobuněčné
tekutiny, do níž se také řadí krevní plazma a míza (lymfa), která se z moku tvoří.
Video: Zánět
Imunitní systém
3. linie obrany - specifická imunitní odpověď
- v případě, že první dvě linie obrany nestačí a infekce se šíří
APC buňky (např. makrofágy) vystavují na povrchu cizí antigeny (Antigen Presenting)
T-lymfocyty jsou tímto informovány o typu patogenu
- Helper T lymfocyty (TH) aktivují jiné buňky
- Cytotoxické T lymfocyty (TC) eliminují infikované a nádorové buňky
B lymfocyty a plasmatické buňky produkují protilátky (sekretují do krve nebo umísťují na buňky)
Aktivace T a B lymfocytů
Při styku s antigenem se lymfocyt zmnožuje a vzniká množství klonů se stejným antigenním receptorem
- nazýváme klonální selekce - základní koncept imunologie a očkování
Klonální selekcí lymfocytů vznikají dva typy buněk:
a) efektorové: krátká životnost, najdou a zničí patogen
- z B buněk → plazmatické - sekretují protilátky
- z T buněk →
- cytotoxické T lymfocyty
- helper T lymfocyty
b) paměťové: vznikají při primární infekci, nejsou aktivní, ale přetrvávají v těle a při další
infekci stejným patogenem jsou rychle reaktivovány k mitóze (imunologická paměť)
Imunitní systém
3. linie obrany - specifická imunitní odpověď
- každý virus a bakterie má unikátní molekulární markery, které jej identifikují
- lymfocyty v těle rozeznávají:
- vlastní antigeny - ty je nechávají klidnými
- cizí antigeny - spouští mitotickou aktivitu (dělení)
Fáze:
1. Rozeznání specifické cizí částice
2. Opakované buněčné dělení a vytvoření obrovské populace klonů lymfocytů
3. Diferenciace do subpopulací efektorových a paměťových buněk
Imunitní systém
3. linie obrany - specifická imunitní odpověď
Antigen-prezentující buňka
- známe 3+1 typ APC: makrofág, B-lymfocyt, dendritická buňka + buňka infikovaná virem
- vystavují na svém povrchu antigeny
- např. makrofág pohltí bakterii a na svém povrchu vystaví její antigeny
- tyto antigeny jsou ve vazbě s MHC
- antigeny jsou rozeznávány lymfocyty
T-lymfocyty (Thymocytes; T-cells)
- líhnou se v kostní dřeni
- putují nezralé do brzlíku (thymus) kde
diferencují a zrají
- v procesu zrání získávají markery CD4 (T-helper
cells TH) a CD8 (Cytotoxic T-cell TC) a antigenně
specifické receptory
- T lymfocyty ignorují buňky s prázdnými MHC
antigeny, stejně jako volně plovoucí antigeny
- váží se však na antigeny, vystavené na povrchu
APC v MHC komplexu
- vazba indukuje rapidní proliferaci do
efektorových a paměťových buněk s receptorem
pro daný antigen
T-lymfocyty (Thymocytes)
1. Efektorové T-helper lymfocyty (CD4)
- sekretují interleukiny → stimulace dalších buněk
- na povrchu mají protein CD4, který se váže na
MHC II molekuly
2. Efektorové cytotoxické T lymfocyty (CD8)
- rozpoznávají infikované či jinak vadné buňky a
vyvolávají u nich APOPTOZU:
a) uvolnění cytotoxických látek
(perforiny+gramzymy), které pronikají do
cytoplasmy a spouští kaspázovou kaskádu
b) exprese povrchového proteinu Fas-ligand,
který se váže na Fas-receptor
- na povrchu mají protein CD8, který se váže na
MHC I molekuly
B-lymfocyty
- prekurzory se tvoří v kostní dřeni u dospělých a játrech plodu
- po dozrání syntetizují jeden typ protilátky
- "virgin" B cell produkuje protilátku (imunoglobulin), která se uchytí v membráně
- aby se B-lymfocyt začal dělit potřebuje:
- kontakt se specifickým antigenem
- aktivaci od T-helper lymfocytu, který už se s daným antigenem setkal na APC buňce (např.
makrofágu)
- Po aktivaci diferencuje B-lymfocyt do efektorové
buňky (= plazmatická buňka) a paměťového B-
lymfocytu
- Plazmatická buňka produkuje masivní množství
volných protilátek
- volné protilátky označují patogen pro zničení fagocyty
a komplementem
- paměťové buňky zůstávají inaktivní během první
infekce, ale při druhé infekci se aktivují mnohem rychleji
než "virgin" B-lymfocyty
- nejmenší část antigenu schopná reakce s protilátkou
nebo receptorem T-lymfocytu se nazývá antigenní
detrminanta neboli epitop
Komplement
Imunitní mechanismus zvyšující (doplňující, komplementující) účinnost protilátek
- nespecifický a neadaptibilní
- soubor malých proteinů, tvořených v játrech a cirkulujících v krvi
- po aktivaci atakuje membrány patogenů, ve kterých způsobuje póry
wikipedia
Vlastnosti B-lymfocytů
1. Mají v povrchu receptor zachycující volný
antigen. Molekula protilátky (imunoglobulin)
vázaná na membránu
2. B-lymfocyt se aktivuje k dělení a diferenciaci
na plazmatickou buňku teprve po kontaktu s
antigenem. Do té doby je v klidu v G0 fázi.
Nutno též potvrzení od TH
Navíc B-cell fungují jako APC. antigen je nabízen
TH-lymfocytům.
Neaktivuje se dokud
nedostane "potvrzení" od T
helper
Antigen-presenting cells (APC; buňky nabízející antigen)
na povrchu vystavují antigen, který je rozeznáván T-lymfocyty
Existují 3+1 typy APC buněk:
1. B-lymfocyty
- detekuje volný antigen pomocí receptoru (povrchový IgM)
- endocytozou se antigen dostává do vezikuly, kde se rozkládá na peptidy
- na ribozomech se syntetizují MHC II-molekuly, které migrují do vezikuly a spojí se s peptidy
- komplex MHC II+peptid putuje k povrchu buňky, kde se vystavuje TH-lymfocytům
- B-lymfocyty s antigeny se vyskytují v lymfoidních folikulách lymfatických uzlin
2. Makrofágy
- pohlcují bakterie a odbourávají jejich proteiny a vystavují v komplexu s MHC II
- vrozená (nespecifická) imunita
- na povrchu receptory pro různé složky mikrobiálních buněk
- rozptýleny po celém těle - lymfatické uzliny, plíce, játra, mozek...
- mohou být i pohyblivé a přecházet mezi tkáněmi (amébovitý pohyb)
- po vazbě TH-lymfocyt navíc produkuje interferon gamma (INF-γ) a tím se ještě víc aktivuje k pohlcování
virů a bakterií
- makrofágy též produkují cytotoxické proteiny
- v krvi se vyskytuje ve formě monocytu
3. Dentritické buňky
- schopné fagocytozy
- komplexy antigenů a MHC I i MHC II
- aktivují tedy jak TH- tak i TC-lymfocyty
Podle místa výskytu dělíme:
a) Langerhansovy buňky
- v pokožce a mukózních tkáních
- přijmou antigen a putují do lymfatických uzlin, kde diferencují na dendritické
buňky a stimulují T-lymfocyty
b) Intersticiální dendritické buňky
- osidlují většinu orgánů (srdce, játra, ledviny...)
c) Proplétající se dendritické buňky
- v sekundárních lymfoidních orgánech spolu s T-lymfocyty
d) Cirkulující dendritické buňky - v krvi (0,1% krevních leukocytů)
wikipedia
(4). Buňky infikované viry
- virus napadne tělní buňku a spustí svou replikaci a transkripci svých proteinů
- virové proteiny mohou být buňkou odbourány a vystaveny na povrchu v komplexu s MHC I
- MHC I + virový antigen je rozeznáván TC-lymfocyty a infikovaná buňka je zničena apoptozou
b) Humorální imunita
zprostředkovaná specifickými protilátkami
produkovanými B-lymfocyty do tělních tekutin
a) Buněčná imunita
zprostředkovaná T-lymfocyty
- TC lymfocyty produkují Fas ligand a
perforiny + granzymy → APOPTOZA
Apoptóza!
Imunoglobuliny (lidské protilátky)
- vyskytují se vázané na povrchu B-lymfocytů nebo volné (IgM a IgD slouží jako receptor)
- volné protilátky označují patogen pro zničení fagocyty a komplementem
- obecná struktura protilátek je velmi podobná
- největší rozdíly jsou na špičce Fab regionu (antigen-binding site), která je extrémně variabilní
- to umožňuje existenci milionů jemně odlišných verzí protilátek
- klasifikace protilátek je založena na typu Fc fragmentu (těžkého řetězce)
Imunoglobulinové třídy:
1. IgA (2 typy)
- hlavně na sliznicích (trávící, dýchací..) a ve slinách, mléku...
- zabraňuje kolonizaci patogeny - vysoká denní produkce
2. IgD (1 typ)
- antigenní receptor na B-lymfocytech - BCR (spolu s IgM)
- aktivuje bazofily a mastocyty k produkci antimikrobiálních faktorů
3. IgE (1 typ)
- váže se na alergeny
- aktivuje bazofily a mastocyty k produkci histaminu
- chrání před parazitickými červy
4. IgG (4 typy)
- v krevním séru tvoří až 80% všech imunoglobulinů
5. IgM (1 typ)
- vázán na membránu B-lymfocytů, kde působí jako receptor pro antigen - BCR
- nejúčinnější ve vazbě virových částic
Imunoglobuliny (produkovány B-lymfocyty)
Protilátky patří do skupiny glykoproteinů, označovaných jako imunoglobuliny
Molekula imunoglobulinu je složena min. ze 4 polypeptidových řetězců
- 2x těžký (H) řetězec (cca 430 aminokyselin)
- 2x lehký (L) řetězec (cca 214 aminokyselin)
Fc region
Fab region
Imunoglobuliny
Konstantní oblast (C)
- relativně neměnná sekvence aminokyselin
- CH pro těžký a CL pro lehký řetězec
Variabilní oblast (V)
- úsek, v němž se imunoglobuliny příslušného typu liší
- VH pro těžký a VL pro lehký řetězec
Hypervariabilní oblasti
- váží antigen
- značně proměnlivá primární struktura
Pantová (hinge) oblast
- ohebnost usnadňuje vazbu na antigen
Glykozylace
- připojení sacharidů N-glykozidovou vazbou
- na různých místech těžkého řetězce
- slouží k ochraně před proteolýzou
Domény
- lehký řetězec má 2 domény (C a V)
- těžký řetězec má jednu V a tři nebo čtyři C domény
Klasifikace lehkých a těžkých řetězců
Lehké řetězce
- 2 typy: κ (kappa) a λ (lambda)
Těžké řetězce
- 5 typů: γ (gamma), α (alfa), μ (mí), δ (delta), ε (epsilon)
- gamma má 4 podtypy a alfa má 2 podtypy
Klasifikace protilátek je založena na typu Fc fragmentu (těžkého řetězce)
VLCLVHCH
indexy lze specifikovat, např. pro IgD:
VκCκVδ Cδ
Cδ
Vδ
Cκ
Vκ
IgD
Imunoglobulinové domény
- skládají se z antiparalelních β-skládaných listů spojených smyčkou
- struktura domény stabilizována vodíkovými vazbami (mezi -NH a -CO)
- každá doména je navíc stabilizována disulfidovou vazbou
- antigen se váže na aminokyselinové zbytky (antigen binding site)
v hypervariabilních úsecích
- při vazbě antigenu dochází ke změně konformace domény
www.thermofisher.com
Molekulární podstata tvorby protilátek
dědí se pouze subgeny (genové segmenty) pro tvorbu imunoglobulinů
VDJ rekombinace (přeskupování genových segmentů)
- proces při kterém T a B lymfocyty náhodně sestavují různé genové segmenty
- k VDJ rekombinaci dochází na DNA buněk v průběhu jejich vývoje, před kontaktem s antigenem
- genové segmenty:
(V) ... variable
(D) ... diversity
(J) ... joining
Cíl: vytvářet jedinečné antigenní receptory,
které společně dokáží rozeznat mnoho druhů
antigenních molekul
U B-lymfocytů vznikají VDJ rekombinací imunoglobuliny
(membránová - BCR - nebo volná forma)
U T-lymfocytů vznikají VDJ rekombinací T-cell
receptory (TCR)
VDJ rekombinace
3 typy genů:
1. pro těžký řetězec: 14. chromosom (5 subtypů za sebou)
2. pro lehký řetězec kappa (κ): 2. chromosom
3. pro lehký řetězec lambda (λ): 22. chromosom
- kombinací vzniklých VDJ přesmykem může být u člověka řádově 1013
- u genů pro lehké řetězce kappa a lambda chybí D segment
VDJ rekombinace u těžkého řetězce (2012.igem.org)
www.bsse.ethz.ch
VDJ rekombinace
Mechanismus VDJ rekombinace
probíhá pouze na DNA nezralých lymfocytů
RSS (recombination signal sequence)
- označuje místo sestřihu (vazba RAG)
RAG1/RAG2 (recombination-activating genes)
- enzymy katalyzující rekombinaci
- vazba na RSS
Video: VDJ rekombinace
Přesmyk imunoglobulinových tříd
- IgM a IgD se tvoří jako první, protože Cμ a Cδ následují na DNA hned za VDJ subgeny
- po VDJ rekombinaci následuje přesmyk tříd z IgM do IgG, IgE nebo IgA
- až po stimulaci antigenem v sekundárních lymfoidních orgánech za podpory TH lymfocytů
- stejný úsek VDJH se připojí k subgenu Cγ, Cα nebo Cε za delece Cμ a Cδ
- přesmyk tříd je řízen "signály přesmyku - S"
https://dokuwiki.noctrl.edu
Receptory T lymfocytů (TCR)
- u člověka má 95% T lymfocytů TCR receptor složený z α (alfa) a β (beta) řetězce (cca 5% TCR je z řetězců
gama a delta - γ/δ)
- V, D a J segmenty v β řetězcích
- V a J segmenty v α řetězcích
- přeskupování probíhá stejně jako u imunoglobulinů - vznik jedinečných receptorů
archive.cnx.org
Vakcinace (očkování)
tvorba paměťových lymfocytů po setkání s antigenem
(větš. oslabený kmen nebo jeho část)
Pravé neštovice (small pox)
- infekční nemoc způsobená virem Variola major
- mortalita 30-35%
- u lidí se pravděpodobně objevila 10 000 let před našim letopočtem
- má na svědomí přibližně 300-500 milionů mrtvých v 20. století
- bývala zodpovědná za asi 1/3 oslepnutí
- v roce 1979 ohlásila WHO úplné vymýcení pravých neštovic díky celosvětovému programu očkování
- v 80. letech bylo zastaveno rutinní očkování dětí ve všech zemích (70. léta v Evropě a USA)
- jediné známé vzorky viru zůstávají v laboratořích v Atlantě a v Moskvě
Snímek viru z elektronového mikroskopu (wikipedia)
Vakcinace (očkování)
Edward Jenner (1749 - 1823)
- doktor z Gloucestershire
- při epidemii pravých neštovic si všiml, že dojičky, které prodělali kravské
neštovice neonemocní
- provedl experiment:
- odebral vzorek kravské neštovice z pacientky Sarah Nelmesové
- nakazil tímto 8-letého chlapce Jamese Phippse
- po zotavení nakazil Jamese pravými neštovicemi - neonemocněl
- očkování nepatentoval, aby mohli být léčeni bohatí i chudí
wikipediaLatinsky "vacca" znamená "kráva"
Vychází ze dvou základních principů (pozorování):
1. Buňky imunitního systému jsou schopny infiltrovat a ničit solidní tumory.
2. Při allogenních transplantacích kostní dřeně docházelo k život ohrožujícímu GVHD, ale též občas k
vyléčení leukémie pomocí efektu GVL (graft versus leukemia).
Allogenic bone marrow
transplantation
Uchycení štěpu GVHD GVL
Vybrané T-cells
Lepší kontrola nad
transplantovanými
buňkami
Imunoterapie
Sadelain et al., Nature 2017
Ex vivo expanze T-cells a
trasfuze do pacientů
Vybrané T-lymfocyty:
- rozpoznají konkrétní rakovinné buňky
- neškodí zdravým buňkám
Odmítnutí štěpu
Vybrané T-cellsImunoterapie
Sadelain et al., Nature 2017
Specifická přestavba T-Cell Receptoru proti danému
antigenu (TCR-CD3 komplex)
MHC ko-signalizace
přirozené klony umělý receptor
CAR 1. generace
CAR 2. generace
Přidána ko-stimulační
komponenta receptoru
(CD28 nebo 4-1BB)
CAR
Chimerický Antigenní Receptor
Plná aktivace a expanze
Neobsahuje celý CD3,
ale jen jeho část CD3ζ
(zeta) řetězec
Nevyžaduje MHC
(HLA) ko-signalizaci
+MycTag
CAR T vs. mAb
Umělý receptor vychází z monoklonální protilátky
• Vysoká hustota CAR na povrchu T lymfocytů vede k vysoké afinitě k antigenům na rakovinných
buňkách
• Cytotoxický mechanismus T lymfocytů je účinnější než u volných protilátek
• CAR T-lymfocyty přetrvávají v organismu déle než volné protilátky
 zvýšený účinek proti relapsu
Milníky ve vývoji CAR-T
1989 Zelig Eshhar
- první CAR (proof-of-principle)
- T cells lze pomocí CAR aktivovat proti vybraným antigenům bez nutnosti MHC-I
CAR-T skepticism
"You can’t put genes into T cells"
"These modified T cells won’t kill cancer in a mouse"
"You can’t bring it to the clinic"
CAR-T field would not exist as it
does today without CD19
C. Rossig, Clin. Immunol. 2017
Michel Sadelain
- CAR-T druhé generace: přidání ko-stimulační molekuly CD28
- umožnilo přežití CAR-T v těle v řádu měsíců
2011 Carl June
- CAR proti B-buněčnému antigenu CD19
- re-transfuze 3 pacientům s chronickou lymfatickou leukemií
- CART expandovaly 1000x
- eliminace lymfomu
- kompletní a trvalá remise
CAR-T v klinice
E. Dolgin, Nature. Biotechnol. 2017
18.10.2017 - FDA schválila druhý CAR-T produkt (Gilead):
- Yescarta (axicabtagene ciloleucel) pro autologní CD19 terapii (dospělí)
- pro léčbu non-Hodgkinova lymfomu
30.8.2017 - FDA schválila první CAR-T produkt (Novartis):
- Kymriah (tisagenlecleucel) pro autologní CD19 terapii akutní lymfoblastické leuk.
- pouze pro dětské pacienty
- FDA schválila použití monoklonální protilátky proti IL-6R
- Actemra (tocilizumab) proti život-ohrožujícím vedlejším efektům (Roche)
Hematologické malignance vs. solidní tumory
Hematologická onemocnění
- B-buněčné malignity jsou pro obor CAR-T klíčové
- CD19 je unikátní cílový antigen exprimovaný na maligních i zdravých B lymfocytech
- při léčbě dochází k B buněčných aplaziím - klinicky zvládnutelné
Solidní tumory jsou komplikovanější
a) často chybí tumor-specifické cílové antigeny
b) exprese cílových antigenů též na zdravých a nepostradatelných buňkách
c) nedostatečná migrace CAR-T do nádorového stroma
Počty klinických studií na CAR-T v hematologických a solidních tumorech. Převzato z ClinicalTrials.gov 2018
134
72
Hematologické malignity Solidní tumory
Početklinickýchstudií
Living drug safety
*CRS - Cytokine release syndrome (cytokinová bouře). A serious and in some cases potentially life-threatening toxicity that has been
observed after administration of natural and bispecific antibodies and, more recently, following adoptive T cell therapies for cancer. CRS is
associated with elevated circulating levels of several cytokines including interleukin-6 (IL-6) and interferon-γ (IFNγ).
* Tocilizumab (Actemra) je původně lék na artrózu
Side effects
1. Cytokine Release Syndrom (CRS*)
- horečky, orgánová selhání
- příčina: aktivace T-cells
- je zvýšen zejména IL-6 - snižuje se pomocí Tocilizumabu*
2. Neurotoxicita
- příčina: neznámá
3. Ztráta účinnosti
- příčiny: a) CAR-Ts přestanou expandovat
b) rakovinné buňky přestanou exprimovat cílový antigen
c) inhibiční efekt nádorového microenvironmentu
4. On-target, off-tumour aktivace T cells
- útočí na zdravé tkáně, nař. plicní