Molekulární biologie pro informatiky (W072) Molekulární biologie pro informatiky Přednášející: Mgr. Lenka Tesařová, Ph.D. Mgr. Pavel Šimara, Ph.D. Doporučená literatura: Úvod do molekulární biologie. Brno, 2006 (4. vydání) Genetika. Brno, 2017 Základy buněčné biologie : úvod do molekulární biologie buňky. (orig. Molecular biology of the cell) Metody molekulární biologie. Brno, 2010 Rosypal a kol.: Snustad a kol.: Alberts a kol.: Šmarda a kol.: BIOLOGIE Stanislav Rozpal METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Jan Šmarda, Jiří Doškář, Roman Pantuček, Vladislava Růžičková, Jana Koptíková Me ©i Molekulární biologie pro informatiky 1. Historie molekulární biologie. Nukleové kyseliny a proteiny 2. Struktura genomu a genetická informace 3. Replikace genomu, reparace a rekombinace DNA 4. Transkripce genomu 5. Translace genomu 6. Regulace genové exprese 7. Molekulární mechanismy signalizace 8. Molekulární struktura eukaryotické buňky 9. Regulace buněčného cyklu 10. Programovaná buněčná smrt a molekulární podstata získané imunity 11. Molekulární podstata nádorových onemocnění 12. Metody molekulární biologie a základy genového inženýrství Molekulární biologie pro informatiky -1 Historie molekulární biologie Nukleové kyseliny a proteiny Ústřední dogma molekulární biologie Replikace DNA (DNA-►DNA) DNA Transkripce zP^tn^ transkripce (DNA-►RNA) L J (RNA-►DNA) ^^xy^X^ RNA ^1 Replikace RNA jj, XLK ^ (RNA-►RNA) Translace (RNA -►protein) 00CH>0 Protein Historie objevů genetické informace 1868 Johann Friedrich Meischer Hrubé extrakty DNA 1919 Phoebus Aaron Theodor Levene Tetranukleotidová hypotéza 1928 Frederick Griffith Transformační princip 1944 Oswald Avery, Colin Munro MacLeod, Maclyn McCarty Transformační princip je DNA 1952 Alfred Hershey, Martha Cowles Chase DNA je nositelkou genetické informace 1953 James Dewey Watson, Francis Crick Objasnění struktury DNA 1956 Heinz Fraenkel-Conrat, Bea Singer RNA jako nositelka genetické informace 1958 Matthew Meselson, Franklin Stáhl Semikonzervativní replikace DNA Griffith - Transformační princip (1928) Streptococcus pneumoniae SS S-kmen: smooth, kapsula dodávající hladký vzhled patogenní (zápal plic u člověka, smrt u myši) mutantní, nepatogenní heat treatment heat treatment S cells Scei'a R cells S ce"'c- o r, o c o R cells >00 ß OO OOO r OO f>7ln OO OO (C**># i-^ß Přenos genetického materiálu mezi ♦ dvěma kmeny bakterií procesem transformace. S cells No cells R cells S cells o o o ooo ooo ooo OO OO OO http://www.trunity.net/ICB-demo/view/article/52446f810cf264abcd85e912/ Avery, MacLeod, McCarty - Transformační princip je DNA (1944) S-kmen S-kmen filtrát A w RNáza jj^ Protéráza R-kmen DNáza I Pouze ošetření vzorku DNázou zabránilo transformaci - transformační substancí je DNA R-kmen S-kmen R-kmen S-kmen R-kmen Genetics, Second Edition © 2005 WH. Freeman and Company Hershey, Chase - DNA je nositelkou genetické informace (1952) Kapsidy fágů zůstávají na povrchu, genetický materiál jde do bakterie. Využití pokroku: mikrobiologie E. coli, izolace fágů, radioizotopy. Během infekce zůstávají proteiny fága vně bakteriální buňky, zatímco DNA fága vstupuje do buněk. Za přenos genetické informace (i u virů) je zodpovědná DNA. http://biology-forums.com/index.php?action=gallery;sa=view;id=392 http://www.slideshare.net/veneethmathew/16-lecture-dna http://c0mm0ns.wikimedia.0rg/wiki/lmage:Tevenphage.png Objasnění struktury DNA 1953 - J. D. Watson, F. Crick, trojrozměrný model 1962 - Nobelova cena, spolu s M. Wilkins DNA je double helix Báze vrstveny kolmo k ose Vzdálenost mezi bázemi (0,34 nm) Průměr šroubovice (2 nm) Počet bazí na 1 otočku (10 bp) 2 nm © 2013 Nature Education http://www.muskingum.edu Fraenkel-Conrat, Singer - RNA jako nositelka genetické informace (1956) TMV - virus tabákové mozaiky - molekula RNA obklopena kapsidem ze spirálovitě uspořádaných molekul proteinu bílkovinný obal (kapsida) Virové potomstvo je shodné s typem, z kterého byla získána RNA, nevykazuje znaky typu, ze kterého byl získán protein. RNA nese genetickou informaci u TMV. http://anisam2.yolasite.com/resources/26augl0lecture3.pdf http://web2.mendelu.ez/af_291_projekty2/vseo/files/8/384.jpg Meselson, Stahl - Se mi konzervativní replikace DNA (1958) i5N i4N Potvrzen semikonzervativní způsob replikace DNA Copyrights Pearson Education. Inc.. publishing as Benjamin Cummmgs. Copyright €> The McGraw-Hill Companies. Inc. Struktura nukleových kyselin Primární struktura • struktura nukleotidů a jejich vzájemné spojení • pořadí, sekvence nukleotidů v řetězci \^ Cytosin Sekundární struktura • stabilní trojrozměrná konfigurace • vzájemná poloha nukleotidů • DNA - šroubovice dvou řetězců (Watson, Crick) • RNA - šroubovice dvou úseků téhož řetězce (vlásenka) Terciární struktura • nadšroubovicové vinutí Kvartérní struktura • uspořádání DNA do chromozomů • struktura nukleozomu, chromatinu Thymin L umínili Dna_strand3.png RNA-comparedto-DNA thymineAndUracilCorrected.png http://www.namrata.co/dna-structure-and-functions-a-quick-revision/tertiary-structure-of-dna/ Primární struktura nukleových kyselin Nukleové kyseliny jsou polymery, jejichž primární struktura představuje vlákno nukleotidů navzájem spojených fosfodiesterovou vazbou. Každý nukleotid se skládá z: Pentóza HOCH 4' ,0 H H OH OH HOCH^x-0 4 H H OH 11 OH H OH v H H Ribóza (RNA) Deoxyribóza (DNA) Fosfát 0" 1 0=P-0" 1 1 0" Dusíkatá báze DNA (A, G, C, T) RNA (A, G, C, U) tue N H O i. NT NH2 NH- NH2 NH H3C Guanin Adenin N "O Cytosin H Tymin NH N^O H Uracil Purinové Pyrimidinové Primární struktura nukleových kyselin Ribonukleotidy v RNA Deoxyribonukleotidy v DNA Nukleosid = cukr + báze Nukleotid = nukleosid + fosfát Volné nukleotidy ve formě trifosfátů Nukleotidy zabudované v NK ve formě monofosfátů Polarita řetězce: 5' konec - fosfátová skupina na 5' uhlíku pentózy 3' konec - OH skupina na 3' uhlíku pentózy 0H 3'konec Sekundární struktura DNA Sekundární struktura DNA představuje trojrozměrnou konfiguraci - základní šroubovicovou strukturu, pro kterou platí: Osa dvoušroubovice 3' (1 (2 (3 (4 (5 (6 (7 (8 dvoušroubovice s cukr-fosfátovou kostrou vně šroubovice a bázemi poskládanými uvnitř molekuly antiparalelní polynukleotidové řetězce s opačnou polaritou komplementarita řetězců, párování bází (A-T, G-C), Chargaffovo pravidlo průměr dvoušroubovice 2 nm vzdálenost mezi páry bazí 0,34 nm, na jednu otočku dvoušroubovice připadá 10 bp, což zabírá vzdálenost 3,4 nm přítomnost většího a menšího žlábku pravotočivé dvoušroubovicové vinutí řetězce jsou vzájemně drženy pohromadě dvěma typy molekulárních interakcí - vodíkové vazby, vrstvení bází Cukr-fosfátová kostra Větší žlábek (1,2 nm) Menší žlábek (0,6 nm) ^ 0,34 nm 3,4 nm http://www.naturexom/scitable/topicpage/discovery-of-dna-structure-and-function-watson-397 Sekundární struktura DNA Párování bází • spojení dvou bází opačných řetězců prostřednictvím vodíkových vazeb • umožňuje separaci řetězců DNA během různých procesů, šíření genetické informace • Watson-Crickovo: specifita A-T, G-C (A-U v RNA) Guanin Chargaffova pravidla • v DNA je stejný počet adeninových a tyminových zbytků • v DNA je stejný počet guaninových a cytosinových zbytků • poměr purinů a pyrimidinů se rovná jedna . A = T G = C A + G = C + T (A+G)/(C+T) = 1 Transferová RNA Primární struktura • 74-95 nuleotidů, 5'-CCA-3' sekvence na 3' konci • neobvyklé báze - vznik posttranskripční modifikací, nenáhodné rozdělení v sekvenci - vliv na párování bazí, přesnost vazby aminokyselin a syntézy proteinů Sekundární struktura • tvar jetelového listu • čtyři ramena, variabilní smyčka Antikodon https://commons.wikimedia.0rg/wiki/File:TI1e_tRNA_cloverleaf_general.svg mamit-trna.u-strasbg.fr Speciální struktury v DNA a RNA Nukleotidové sekvence • jedinečné - v molekule se vyskytují pouze jedenkrát • repetitivní - v molekule se mnohonásobně opakují Repetice • jednotka repetice - opakovaná sekvence • délka repetice - počet nukleotidů, které ji tvoří • četnost repetice - počet jednotek dané repetice v haploidním genomu (molekule) 1. Přímá: sekvence opakovaná ve stejném směru na temže řetězci DNA 5'.....ATGC..........ATGC.....3' 2. Tandemová: přímá repetice, u které se jednotka opakuje bezprostředně za sebou 5'.....GATA/GATA/GATA/GATA.....3' 3. Obrácená: sekvence opakovaná na stejném nukleotidovém řetězci ve své komplementární podobě jako palindrom se označují přilehlé obrácené repetice 5'.....ATGC..........G C AT.....3' 5'.....ATGC/GCAT.....3' Speciální struktury v DNA a RNA 3. Obrácená: spárováním na ssDNA mohou tvořit vlásenku, vlásenku se smyčkou spárováním na dsDNA mohou tvořit křížovou strukturu, křížovou strukturu se smyčkou ,_T G C G A T ACTC A T C G C A__ „, 5 4-ITT TTTT TT1-► 3 T A ■--■ H--M ■--■ ■--■ ■--■ 5'«-rrP C -+ 3' TGCGATACTCATCGCA A.CGOTATG A G TACCGT I "—m- 3' < "I -m— _|_U->s M " Bakteriálni . J$jjtm Ribonukleáza P 4. Dlouhá koncová repetice: LTR sekvence, dlouhá přímá repetice na obou koncích téhož DNA řetězce konce LTR sekvence jsou navzájem ve vztahu obrácených repeticí 5-ATGC......G C AT.................. .................ATGC......GCAT-3' LTR LTR 5. Rozptýlená: jednotlivé kopie se vyskytují na různých místech haploidního genomu http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course_material/nucleic_acids.html https://en.wikipedia.Org/wiki/Ribonuclease_P#/media/File:RF00010.jpg Terciální struktura DNA Escherichia coli Lidská buňka DNA-4,7 miliónů bp - délka 1,6 mm velikost buňky 3 u,m DNA - 6 miliard bp -délka 1,8 m velikost jádra 6 u,m Chromozomální DNA existuje ve formě dlouhých molekul, které se musí vejít do mnohem menších buněk. Terciární struktura DNA - organizace DNA vyššího řádu, která umožňuje umístit ji do omezeného prostoru buňky. Terciální struktura DNA Nadšroubovice (superhelix) Vzniká, když je do dvoušroubovice DNA zavedeno další vinutí 1. relaxovaná DNA - dvoušroubovice bez nadšroubovicového vinutí, stav s nejnižší energií 2. záporná nadšroubovice - vznik odvíjením řetězců, pravotočivá nadšroubovice 3. kladná nadšroubovice - vznik svinováním řetězců, levotočivá nadšoubovice Předpoklad pevných konců • kružnicová dsDNA • lineární dsDNA připevněná k substrátu Maria Barbi et al. Interface Focus 2012;2:546-554 Rosypal, Úvod do molekulární biologie. Terciální struktura DNA Topoizomerázy Přidávají či odstraňují závity v dsDNA dočasným zlomem řetězců, obtočením konců kolem sebe a následným spojením zlomených konců. Typl • jednořetězcové zlomy, přemísťují řetězec přes zlom v druhém řetězci v rámci dvoušroubovice Typ II • dvouřetězcové zlomy, přemísťují dsDNA přes zlomy obou řetězců v dsDNA dsDNA 31 5' n n-1 Většina DNA v buňce ve formě záporné nadšroubovice • snazší separace řetězců během replikace a transkripce • sbalení do menšího prostoru v buňce http://helicase.pbworks.eom/w/page/17605720/Tyler-Huff https://www.studyblue.eom/notes/note/n/the-structure-of-dna-and-rna-lecture-l/deck/13577968 Kvartérní struktura DNA Viz přednáška č. 2 ©The McGraw-Hill Companies, Inc. Primární struktura proteinů Pořadí standartních aminokyselin v polypeptidovém řetězci Aminokyseliny (AK) • uhlík a, na který se váže vodík r karboxylová skupina aminoskupina postranní řetězec 1. AK s nepolárním zbytkem - hydrofobní glycin (Gly, G), alanin (Ala, A), valin (Val, V), leucin (Leu, L), izoleucin (lle, I), fenylalanin (Pne, F), tryptofan (Trp, W), metionin (Met, M), prolin (Pro, P) Gly Ala Val Leu o lle CH—COOH I NH2 Primární struktura proteinů 2. AK s polárním zbytkem - hydrofilní, vodíkové vazby s molekulami vody tyrozin (Tyr, Y), asparagin (Asn, N), glutamin (Gin, Q), serin (Ser, S), treonin (Thr, T), cystein (Cys, C) ooo Tyr Asn Gin Ser n Thr o Cys o O H2N-CH—C-OH HjN CH C OH ^ ^__^_£ Čh? H2N-CH — C-OH "2" Yn U Un H,N-CH —C-OH H2N-CH —C-OH CH; I 9Hz (L CH—OH CH2 C^=0 yM2 c=o OH CH3 NH SH 3. AK s kyselým zbytkem - karboxylová skupina kyselina asparagová (Asp, D), kyselina glutamová (Glu, E) A o Asp H2N-CH—C-OH GlU CH2 I C=0 OH H2N-CH—C-OH ch, ch2 c=0 oh Primární struktura proteinů 4. AK se zásaditým zbytkem - kladný náboj postranního řetězce 5. selenocystein histidin (His, H), arginin (Arg, R), lyzin (Lys, K) o O o II •!.!■.-CH—C-OH His S Arg HjN_CH_JJ_0H Lys SeC 0 H2N-CH—C-OH j H2N-CH—C-OH i u CH, I I L CH2 NH I \\ / c=«h |H' SeH nh _ 1^ NHj Vznik primární struktury proteinů • tvorba peptidové vazby mezi -NH2 skupinou na uhlíku a jedné aminokyseliny a -COOH skupinou na uhlíku a jiné aminokyseliny s vyloučením vody H H H \ I '/ N —C —C O H I H \ OH H H s i * N —C —C ' I X H O OH H \ r R i O 11 H i R i 1 C - II C - 1 - N 1 -C 1 H 1 H o Peptidová vazba OH + H20 O o HoN-CH-C-NH—CH-C-NH —CH-C-OH / CH, N-konec CH(CH3)2 Ala-Val-Cys CH2SH \ C-konec Primární struktura proteinů Chemické modifikace standardních AK 1. fosforylace - připojení fosfátu k -OH skupině Ser, Tyr, Thr - fosfoproteiny, negativní náboj 2. acetylace - připojení acetylové skupiny k -NH2 skupině Lys 3. metylace - připojení metylové skupiny k Lys, His -oh 4-hydroxyprolin 4. glykozylace - připojení oligosacharidu nebo polysacharidu, glykoproteiny - N-glykozidová vazba sacharidu k -NH2 skupině Asn, Gin, Trp - O-glykozidová vazba sacharidu k-OH skupině Ser, Thr 5. hydroxylace - připojení hydroxylové skupiny k Pro, Lys H2N-CH—C-OH I CH2 I I o=p-o- I oh fosfoserin H2N-CH—C-OH -ch3 metylhistidin O H2N-CH — C-OH H,N-CH—C-OH I CH, I CH, CH, I r NH I 0=c-ch3 acetyllyzin h h manozyltryptofan manozylserin Primární struktura proteinů obsahuje veškerou informaci pro tvorbu vyšších struktur polypeptidu a vyjádření jeho biologické funkce. Sekundární struktura proteinů Nekovalentní vazby proteinů • tvoří se mezi atomy či skupinami atomů v rámci jednoho polypeptidového řetězce či mezi řetězci Disulfidová vazba - tvoří se mezi -SH skupinami cysteinu uvnitř jedné molekuly proteinu Tyto interakce spolu s rozložením polárních a nepolárních AK v polypeptidovém řetězci ovlivňují celkový tvar a konformaci proteinu. Proces tvorby sekundární a terciální struktury proteinu se nazývá sbalování proteinu, ke kterému dochází během syntézy proteinu na ribozomu. O-h I H ,CH2OH CH2COOH O / \ H H (b) (CH2)4-NH3 + (a) http://2012booksJardbucket.org/books/introduction-to-chemistry-general-organic-and-biological/s21-amino-acid Sekundární struktura proteinů a-šroubovice (a-helix) • stočený polypeptidový řetězec stabilizovaný vodíkovými vazbami mezi -CO a -NH skupinami dvou peptidových vazeb • jeden závit - 0,54 nm; 2 vodíkové vazby; 3,6 AK • průměr -1 nm • délka kolem 10 AK p-skládaný list • úseky o 5-10 AK položeny vedle sebe a spojeny vodíkovými vazbami mezi -CO a -NH skupinami dvou peptidových vazeb odlišných úseků • úseky mohou být orientovány - paralelně: směr od C-konce k N-konci poskládaných úseků je stejný - antiparalelně: směr od C-konce k N-konci úseků je opačný Ú-C—C H Ire M V ft a-šroubovice P-skládaný list v* C W O C \\ Aktivn í m isto \ Substrát. Substrát Aktivní místo Enzym Zkřivené aktivní místo Alosterické Alosterický Alosterické Alosterický^^/ místo aktivátor misto inhibitor Alosterické aktivace Alosterické inhibice Další funkce proteinů: struktura buňky, transport látek přes buněčné membrány, pohybové mechanismy buněčných struktur, regulace růstu a diferenciace buněk, přenos specifických signálů v rámci buněčné komunikace, receptory v membráně buňky, protilátky v imunitní obraně. Základem funkce proteinů je schopnost rozpoznávání = proces specifického spojení dvou biologických makromolekul nebo biologické makromolekuly s malou molekulou, které spočívá v nekovalentních interakcích (především vodíkových vazbách). http://academic.pgcc.edu/"'kroberts/Lecture/Chapter%205/enzymes.html Vazebné interakce proteiny-DNA Molekulární podstata rozpoznání DNA proteiny • nejčastěji se využívá vazba ct-helixu s větším žlábkem na DNA (přístupnější, více vazebných míst) • okolní oblasti napomáhají umístění a-helixu do žlábku • bez korespondence specifických sekvencí proteinu a DNA • skupiny proteinů se společným motivem (krátký úsek proteinu s typickou strukturou), pomocí kterého se váží na DNA Proteiny s motivem helix-otáčka-helix (HTH-jednotka) • dva a-helixy (7 a 9 AK) mezi kterými je jedna beta otáčka (4 AK) • H2 je rozpoznávací, Hl má upevňovací funkci http://carrot.mcb.uconn.edu Vazebné interakce proteiny-DNA Proteiny s motivem homeodomén • HTH-jednotka s upevňovací funkcí • 3. helix umístěný ve větším žlábku DNA Transkripčně aktivační doména ► Homeodoména DNA Proteiny s motivem zinkových prstů • 3-9 tandemových repetic o 29-31 AK • sekvence držena ve tvaru smyčky iontem zinku, na který se váží 2x Cys a 2x His • každý prst obsahuje antiparalelní (3-skládaní list a a-helix, který se váže ve větším žlábku DNA O O \ / Zn / \ •. I •• ř ř I •. s ytf %yp • ••• • ••• y>p •••••• *••••• •••••• •••••• •• http://slideplayer.cz/slide/2988178/ www.genomebiology.com http://www.mun.ca/biology/scarr/IGl_09_RB2.html secondhand-science.com Vazebné interakce proteiny-DNA Proteiny s motivem leucinového zipu • dva a-helixy (30 AK) s pravidelným opakováním Leu • dva zásadité helixy vážící se na DNA • výskyt u transkripčních faktorů, kdy dimerizace umožňuje tvorbu homo a heterodimerů různých transkripčních faktorů Rosypal, Úvod do molekulární biologie https://en.wikipedia.Org/wiki/Myc#/media/File:C-Myc-DNA_complex.png Zvídavé otázky • Jaká je největší vzdálenost fosfodiesterové kostry DNA od osy dvoušroubovice? • Dopíšte k zadanému vláknu komplementární vlákno, aby se obnovila dvoušroubovice. 5CATTGAGT3' • Procentuální zastoupení cytozinu v molekule dvoušroubovicové DNA je 40 %. Jaké je v této molekule procentuální zastoupení tyminu? • Které z těchto vztahů platí pro procentuální zastoupení bází v dvoušroubovicové DNA: (a) C + T = A + G (b) C/A = T/G • Jak se liší nukleotid RNA od nukleotidu DNA? • Jaké purinové a pyrimidinové báze lze najít ve struktuře RNA, DNA? • Které DNA báze jsou schopné mezi sebou tvořit vodíkové vazby (dle základního Watson-Crickova párování bází)? • Uveďte libovolnou sekvenci jednovláknové DNA, která by mohla vytvořit vlivem párování bazí vlásenku se smyčkou. • Které aspekty ve struktuře dvoušroubovicové DNA přispívají k stabilitě její molekuly?