Molekulární biologie 4. Transkripce Transkripce (přepis) genetické informace z DNA do RNA Hlavní zdroje: S. Rosypal, Úvod do molekulární biologie 1-4, Masarykova Universita Brno, ISBN 80-902562 Snustad D., Simmons M., GENETIKA, Masarykova univerzita Brno ISBN 978-80-210-8613-5 Osnova 1. Transkripce (prokaryotického) bakteriálního genomu 2. Transkripce eukaryotického genomu 3. Posttranskripční úpravy RNA a mechanizmy sestřihu • http://image.slidesharecdn.com/replicationtranscriptiontranslation2012-140317172230-phpapp01/95/rep lication-transcription-translation2012-24-638.jpg?cb=1395077017 Replikace vs. genová exprese Přenos genetické informace: •replikace (přenos z DNA do DNA, z generaci na generaci), •z DNA do proteinu (2 kroky: transkripce a translace – exprese genetické informace/genová exprese). Replikace vs. transkripce Transkripce (syntéza RNA) katalyzována RNA polymerázou je v mnoha ohledech podobná syntéze DNA (replikaci). Hlavní rozdíly: 1. Prekurzory jsou ribonukleozidtrifosfáty místo deoxyribonukleozidtrifosfátů. 2. RNA polymeráza místo DNA polymerázy. 3. Pouze 1 vlákno DNA (transkript) slouží jako templát (předloha) pro syntézu komplementárního vlákna RNA. 4. Transkripce začíná navázáním RNA-polymerázy na specifickou sekvenci - promotor (replikace začíná nasednutím primeru). •Transkripce: přenos gen. Info z DNA do RNA, Translace: přenos z RNA do proteinu Transkripce obecně •Transkripce je přenos genetické informace z DNA do RNA; translace je přenos z RNA do proteinu. •Pouze 1 vlákno DNA (transkript) slouží jako templát (předloha) pro syntézu komplementárního vlákna RNA pomocí enzymu RNA-polymeráza. •RNA-polymeráza se váže na specifickou sekvenci (promotor – počátek transkripce) spolu s transkripčními faktory. Vzniká transkripční bublina: lokální rozvinutí DNA pomocí RNA-polymerázy. •Syntéza RNA probíhá v směre 5´→ 3´ z promotoru připájením ribonukleozidtrifosfátů na základě komplementarity: pravidla o párování bází. •Pravidla o párovaní bází jsou stejné jako při replikaci až na jeden rozdíl: v RNA se adenin páruje s uracilem (v DNA se adenin páruje s tyminem). •Vzniklá molekula RNA je komplementární k templátové DNA. http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_09.jpg RNA (ribonukleová kyselina) •5 hlavních typů RNA: mRNA (messengerová; mediátorová), rRNA (ribozomová), tRNA (transferová), snRNA (malá jaderná), miRNA (mikroRNA). •Jenom mRNA podléhá translaci do proteinů. Ostatní typy RNA jsou již konečné funkční produkty. •Transkripcí strukturních genů vzniká mRNA. •Funkce mRNA: fungují jako spojky přenášející genetickou informaci z DNA do ribozomů, kde probíhá proteosyntéza (samotný vznik proteinů). Differences between DNA and RNA Transkripce prokaryot versus eukaryot Základní rysy transkripce jsou stejné, ale v mnoha detailech se liší. Prokaryota Eukaryota Místo transkripce: v cytoplazmě. Místo transkripce: v jádru. Simultánní transkripce a translace. Transkripce a translace jsou odděleny časově i místně. mRNA je přímo přepisována z templátu DNA bez úprav. Z templátu DNA jsou vytvořeny pre-mRNA, které jsou dále upravovány. RNA-polymeráza se skládá z 5 podjednotek. Jen jeden typ polymerázy. RNA-polymeráza se skládá z 10-17 podjednotek. 5 typů polymeráz. RNA-polymeráza spolu se sigma faktorem se přímo vážou na promotor. RNA-polymeráza rozpoznává promotor pomocí transkripčních faktorů. Transkripce prokaryot • Transkripce prokaryot •Část DNA přepisována do RNA se označuje jako transkripční jednotka – může zahrnovat až několik genů. •Vzniklá RNA je tzv. primární transkript, který je často polygenní/polycistronní (typické pro bakterie). •3 fáze transkripce: (1.) iniciace nového řetězce RNA, (2.) elongace řetězce a (3.) terminace transkripce uvolněním vzniklé RNA. •Kompletní RNA-polymeráza (holoenzym) – jeden typ s 5 podjednotkami. What is Bacterial Transcription? Definition, Key Terms & Steps - Biology Reader 1. Iniciace 3 fáze iniciace: 1. vazba holoenzymu RNA polymerázy na promotor na DNA, 2. lokální rozvinutí obou vláken DNA pomocí RNA-polymerázy – vznik volného templátového vlákna DNA, 3. tvorba prvních osmi až devíti fosfodiesterových vazeb. • Po 3. kroku iniciace se pak uvolní sigma faktor a RNA-polymeráza zahájí fázi elongace. Promotor je specifická sekvence DNA, která je součástí transkripční jednotky, nasedá na něj RNA-polymeráza. •Liší se určitými specifickými sekvencemi, co ovlivňuje míru afinity k RNA-polymeráze. •Silný/slabý promotor - vysoká/nízká frekvence iniciace transkripce. - Silnější promotor se více blíží konvenční sekvenci v místech: a) kolem nukleotidu -35: 5' TTGACAT 3' b) Pribnowův box* (-10): 5' TATAAT 3' • • • • • • • • T operátor •Transkripční jednotka (operon) je část DNA přepisována do RNA složena z promotoru, operatoru a genů. Je řízena promotorem a také regulační oblastí – operátorem. •Na operátor se může vázat regulační protein represor, který zastavuje transkripci. https://diaryofanalevelstudent.files.wordpress.com/2013/02/lactose-absent.jpg Shineova-Dalgarnova sekvence • Je konzervativní sekvence v prokaryotických mRNA, která je komplementární k sekvenci v blízkosti 5' konce 16S rRNA. • Nachází se mezi promotorem (popř. za operátorem) a prvním strukturním genem. • Zajišťuje vazbu na ribozom a nepřekládá se. Shineova-Dalgarnova sekvence: 5' AGGA 3' Sekvence na ribozomu: 3' UCCU 5 • Pokud primární transkript neobsahuje S-D sekvenci, nemůže se vázat k ribozomu a působí jako funkční RNA. • http://faculty.samford.edu/~djohnso2/44962w/405/08/f8-08-0.jpg 2. Elongace •Elongace (prodlužování) řetězce RNA nastává po uvolnění sigma faktoru z RNA-polymerázy v místě transkripční bubliny. •RNA-polymeráza při svém pohybu v směre 5' → 3' po DNA průběžně rozvíjí DNA a po přepise obnovuje její vinutí. •Vznikající RNA řetězec je vytěsňován z templátového DNA vlákna. •Oblast přechodného párování bází mezi rostoucím řetězcem a templátem DNA je krátká , pouze tři páry bází. 3. Terminace •Nastává v okamžiku, kdy RNA-polymeráza zachytí terminační signál → rozpad transkripčního komplexu, uvolnění vzniklé RNA. • •2 typy terminátorů transkripce: A) nezávislé na rho-faktoru, B) závislé na rho-faktoru. A) Terminátory nezávislé na rho •Tento typ terminátoru obsahuje oblast bohatou na GC, za kterou následuje šest a více párů bází AT (oblast slabých vodíkových vazeb). •Oblasti bohaté na GC obsahují invertované repetice, které se po transkripci párují na základě komplementarity a vytvářejí vlásenkové struktury. •Vlásenky zpomalují pohyb RNA-polymerázy po DNA – prodlužování je přerušeno. • Image result for nusa protein B) Terminátory závislé na rho •Součástí je rovněž tvorba vlásenkové struktury, která zastavuje RNA-polymerázu. •Terminátory závislé na rho navíc obsahují sekvenci rut (rho utilisation) v blízkosti 3' konce transkriptu, zajišťující vazebné místo pro protein rho. •Rho se naváže na sekvenci rut a pohybuje se s RNA-polymerázou. •Když RNA-polymeráza narazí na vlásenku, zastaví se a protein rho projede vlásenkou a svou helikázovou aktivitou uvolní párování mezi bázemi DNA a RNA (za spotřeby ATP) → uvolení transkriptu. 1. http://i.imgur.com/H7wRD.png amolecularmatter.tumblr.com sigma faktor Prokaryotická mRNA • posttranskripčně se neupravuje a slouží přímo pro tvorbu polypeptidu. • U prokaryot jsou geny polycistronní (více genů na jednom transkriptu mRNA). • Rozpad během několika minut účinkem ribonukleázy (RNázy) ve směru 5' → 3' . • • Translace mRNA na ribozomu probíhá současně s její transkripcí. Polypeptidový řetězec se začne syntetizovat ještě před ukončením transkripce. • Rychlosti: 40 nukleotidů za sekundu; 13 aminokyselin za sekundu; až 15 iniciací transkripce za minutu u jedné transkripční jednotky. http://gcat.davidson.edu/mediawiki-1.19.1/images/0/0e/Prokaryote.jpg Polyribozom: více ribozomů na jedné mRNA urychluje translaci. Spojení transkripce s translací umožňuje efektivní syntézu proteinů (např: 15 molekul mRNA, každá pokryta 30 ribozomy). Prokaryotická rRNA • Vytváří spolu se specifickými bílkovinami buněčnou struktúru – ribozom. • • Geny pro rRNA na chromozomu v 5-9 kopiích. • Každá transkripční jednotka má 2 promotory (P1, P2) a 2 terminátory (T1, T2) • Mezi některými geny jsou vmezeřeny geny pro tRNA • Nejprve přepis do pre-rRNA: sedimentační koeficient 30S • 30S jsou štěpeny RNázou III na sekvence 5S, 16S a 23S Jednotka S (Svedberg) - sedimentační koeficient (veličina udává čas, za který proběhne sedimentace dané makromolekuly při její ultracentrifugaci) Prokaryotická tRNA • Zajišťuje přenos aminokyselin pro začlenění do polypeptidového řetězce při translaci. • jen jeden promotor, poslední gen je strukturní (např. pro elongační faktor EF-Tu) • strukturní gen umožňuje vazbu na ribozom, protože obsahuje Shineovu-Dalgarnovu sekvenci Transkripce eukaryot • Transkripce eukaryot •Složitější – RNA se syntetizuje v jádře – vznik primárních transkriptů → mRNA se musí přenést k ribozomům do cytoplazmy. •Každá molekula eukaryotické mRNA obsahuje oblast pouze 1 genu (jsou monogenní) → monocistronní mRNA (u prokaryot polycistronní). •5 různých RNA polymeráz. •Pre-mRNA podléhá 3 základním post-transkripčním modifikacím. •Soubor primárních transkriptů v jádře se nazývá heterogenní jaderná RNA (hnRNA). • •RNA-transkripty už během syntézy pokrývají RNA-vazebné proteiny, které jich chrání během úprav a transportu před ribonukleázami. •Poločas rozpadu eukaryotické RNA: cca 5 hodin, u prokaryotické RNA: cca 5 minut. http://image.slidesharecdn.com/replicationtranscriptiontranslation2012-140317172230-phpapp01/95/rep lication-transcription-translation2012-24-638.jpg?cb=1395077017 Eukaryotic pre-mRNA processing | RNA splicing (article) | Khan Academy 3 modifikace RNA 1. K 5'-koncům primárních transkriptů se připojují 7-metylguanozinové čepičky. 2. Ke 3'-koncům se připojují úseky poly(A) – polyadenilací vznikají polyadenozinové ocásky (20-200 nukleotidů). 3. Pokud jsou přítomny introny, probíhá jejich vyštěpení. Typy RNA Kódující RNA • Informace z DNA je přenesena pomocí mRNA do ribozomu, kde je přeložena do sekvence aminokyselin tvořících proteiny. • Tvoří asi jen 3% všech transkriptů. • Patří sem exony v pre-mRNA: prekurzorová mRNA (též hnRNA). Nekódující RNA • Cca 97% transkriptů – regulační funkce. • Tvoří ji zejména introny vystřižené z mRNA, rRNA, tRNA a regulační RNA (snRNA, miRNA, siRNA atd.). • Regulační RNA Jsou to krátké molekuly RNA se sekvencí komplementární k určitým částem mRNA nebo DNA. • Mají schopnost inhibovat genovou expresi vazbou na mRNA. • Působí mechanismem RNA interference (RNAi) – dvouvláknová RNA bráni expresi genu , který je alespoň částečně homologní s touto RNA. • Patří sem: – miRNA (microRNA) regulace genové exprese – siRNA (small inhibitory RNA) • miRNA •Krátké interferující RNA, 21-22 nukleotidů, vzniká z pre-miRNA. •Funkce: RNA silencing a post-transkripční regulace genové exprese. o RNA silencing: štěpení řetězce mRNA na dva kusy (endonukleázami), destabilizace mRNA zkracením poly(A) konce (dřívější degradace exonukleázami). oPost-transkripční regulace genové exprese: párování s komplementárními sekvencemi mRNA – snížení účinnosti translace do proteinu na ribozomu (fyzicky blokuje). siRNA •Malá inhibiční RNA, 20-25 nukleotidů. •Funkce: post-transkripční RNA silencing. 5 typů RNA-polymeráz •Složitější, pro zahájení transkripce vyžadují pomoc proteinů: transkripčních faktorů. •Každá má svůj specifický promotor (bakterie: jeden typ RNA-polymerázy a jeden typ promotoru) • • • Enzym Umístnění Produkty RNA-polymeráza I Jadérko rRNA, kromě 5S rRNA RNA-polymeráza II Jádro Jaderné pre-mRNA RNA-polymeráza III Jádro tRNA, 5S rRNA a další snRNA RNA-polymeráza IV Jádro (rostlina) Malé interferující RNA (siRNA) RNA-polymeráza V Jádro (rostlina) Některé siRNA + nekodujíci transkripty siRNA 1. Iniciace (RNA-polymeráza II) Navázaní transkripčního faktoru (TF) na promotor DNA → vytvoření iniciačního komplexu pro navázaní RNA-pol. II. Transkripční faktory •Vyžaduje spoluúčast několika základních (bazálních) transkripčních faktorů (TF). •Účinnost iniciace ovlivňují další TF a regulační sekvence zesilovače (enhancers) a tlumiče (silencers). •Pro efektivní iniciaci musí základní TF interagovat s promotory ve správním pořadí. •Všechny základní TF se označují TFIIX. Promotory (RNA-pol. II) Konzervativní krátké sekvence na DNA rozpoznávany TF. 1. TATA-box (též Hognessův box): T A T A A A A - Nejblíže k místu začátku transkripce (nuleotid +1). - Má důležitou úlohu při začátku transkripce: vazba TFIID - specificky rozeznáván RNA-polymerázou II. - 2. CAAT-box: G G C C A A T C T - Nukleotidy -75 až -80. - Vazba TF CTF/NF1, zvyšuje sílu promotoru (enhancer). 3. GC-box: G G G C G G - nukleotid -90. - vazba TF SP1, zvyšuje sílu promotoru (enhancer). - je fosforylován proteinkinázou vázanou na DNA - stimulace tvorby přediniciačního komplexu - umožňuje vazbu TFIID na TATA-box. 4. Oktamer: A T T T G C A T - váže se na konstitutivní TF OCT-1 5. Startovací nukleotid: Iniciátor (Inr-element) - obvykle A uvnitř úseku s pyrimidinovými bazemi (C nebo T) 1. Iniciace (RNA-polymeráza II) 1. Navázaní TFIID na promotor v místě TATA-boxu. 2. Postupné navazování dalších TF (TFIIA+B+D+F+E+H). 3. Vytvoření iniciačního transkripčního komplexu: začátek elongace pre-mRNA. http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_12.jpg Význam transkripčních faktorů: "Umožňují rozeznat místa, kam se má navázat RNA-polymeráza II a aktivují ji." 2. Elongace a připojení čepičky na 5' konec RNA •RNA-polymeráza II elonguje řetězec RNA stejným mechanizmem jako u prokaryot. •Na počátku elongace se modifikují 5' konce pre-mRNA přidáním 7-metylguanozinové čepičky. •Funkce čepičky: ochrana před degradací a iniciace translace. File:Figure 15 03 02.png - Wikimedia Commons http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_18.jpg 3. Terminace a přidání poly(A) na 3' konec RNA •3' konec RNA vzniká endonukleázovým štěpením primárního transkriptu (nikoli terminací transkripce): •Po směru v místě vzdáleném 11-30 nukleotidů od polyadenylačního signálu (AAUAAA). •Proti směru v místě bohaté na GC na konci transkripční jednotky. •Po vytvoření 3' konce RNA: poly(A)-polymeráza přidává na 3' konec až 200 zbytků adenozinmonofosfátu → polyadenylace. •Funkce poly(A) konce: ochrana před degradací, export z jádra do cytoplazmy. •Vznik pre-mRNA. • Post-transkripční úpravy RNA a mechanizmy sestřihu • Post-transkripční úpravy RNA Primární transkripty jsou dlouhé molekuly a musí být zkráceny, aby mohly být transportovány z jádra do cytoplasmy. a) modifikace, které neovlivňují primární strukturu: - tvorba komplexů jaderné pre-mRNA s proteiny - úprava 5'-konce pre-mRNA tzv. čepičkou - polyadenylace 3'-konce pre-mRNA b) úprava primární struktury: sestřih (vystřižení intronů ); editace. • http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_20.jpg Intron (intragenic region): nekódující sekvence RNA uvnitř genu, která je vystřižena Exon (expressed regions): kódující sekvence RNA, přeložená do proteinů Sestřih RNA 3 mechanizmy sestřihu: 1. Introny pre-tRNA se vyštepují přesným endonukleázovým štěpením → ligace. 2. Introny pre-rRNA se vyštepují autokatalytickou reakcí samotní molekulou RNA. 3. Introny pre-mRNA (hnRNA) se odstraňují pomocí spliceozomov v jádře. Sekvenční signály pro sestřihy se nacházejí na koncích intronů. Sestřih pre-tRNA 2 fáze: 1. Transkript se sestřihne na konci intronu sestřihovou endonukleázou vázanou na jaderní membráně. 2. Sestřihová ligáza spojí dvě části tRNA, vzniká zralá forma tRNA bez intronu. Specifita reakcí je dána v trojrozměrné struktuře pre-tRNA, ne v sekvenci. Sestřih pre-rRNA Intron se vyštepuje bez účasti enzymu – autokatalytický sestřih (samosestřih). Sestřih pre-mRNA •Sestřih pomocí komplexů RNA (snRNA) a proteinů – částice snRNP, které tvoří spliceozomy. •Primární struktura intronu určuje místo sestřihu. •Vlastní sestřih probíhá pomocí chemické reakce: transesterifikace (přeměna fosfátového esteru v jiný bez hydrolýzy za nepřítomnosti ATP nebo GTP). Spliceozom Komplex proteinů a RNA, který katalyzuje sestřih intronů z primárních transkriptů (pre-mRNA) jaderných genů eukaryot. • http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_22.jpg Spliceozom http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_21.jpg mRNA je výsledkem spojení exonů na stejné molekule primárního transkriptu (výjimečně dvou různých molekul - bimolekulární sestřih) Konstitutivní vs. alternativní sestřih (splicing) a) Konstitutivní: po sestřihu vždy stejná molekula mRNA → stejný protein. b) Alternativní: vzniká více druhů molekul mRNA → různé izoformy proteinů: funkčně příbuzné proteiny, liší se v primární struktuře. - regulace exprese, - regulace poměrů izoforem. Příklady genů podléhající alternativnímu sestřihu: imunoglobulinový gen, T-buněčné receptory. Může se intron též překládat do proteinu? Výjimečně ano. Intron retention většinou u rostlin, méně u živočichů. a) Introny nebo jejich části mohou být výjimečně přepisovány do proteinů - antigen na lidském melanomu (Lupetti 1998) nebo isoforma proteinu CEACAM6 (Kurio 2008). b) Sestřihlá mRNA se zachovanými introny vycestuje z jádra, při translaci ale dojde kvůli intronu k předčasnému ukončení a transkript je degradován - regulační mechanismus - zabrání se translaci. c) Introny mohou zůstat v UTR (untranslated region) kde regulují translaci, ale samy se nepřekládají (Remy 2014) Alternativní sestřih http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_23.jpg potenciální exon http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/21_23.jpg potenciální exony Posttranskripční úpravy genoforu mitochondrií • • Nepodléhají úpravě 5'-konce čepičkou • Začínají vedoucím kodonem AUG. • Nejdůležitější úpravou je polyadenylace. Editace RNA • Probíhá v mitochondriích trypanzom, vyšších rostlin a v genu pro apolipoprotein savců. • Cílena inzerce, delece nebo substituce nukleotidu mRNA s cílem pozměnit výsledný protein. • Kryptogen: strukturní gen s možností editace mRNA. • Proces regulován tzv. gRNA (guide RNA). • • • • • • • Video – animace transkripce a translace: https://www.youtube.com/watch?v=4SlZ15yf-Qk DNA Transcription Lesson for Kids: Definition & Steps | Study.com