Profilování	
  modelových	
  T-­‐buněčných	
  
metagenomů	
  s	
  krátkými	
  ready	
  
IV105	
  -­‐	
  Seminář	
  z	
  bioinforma5ky	
  
podzim	
  2014	
  
Tomáš	
  Reigl,	
  357888@mail.muni.cz	
  
Obsah	
  
•  TCR	
  (T-­‐cell	
  receptor)	
  
•  iSSAKE	
  
•  Proces	
  skládání	
  
•  Data	
  
•  Ukázka	
  
TCR	
  (T-­‐cell	
  receptor)	
  
•  vysoká	
  variabilita	
  –	
  až	
  1018	
  klonotypů	
  (alespoň	
  107)	
  
•  V–(D)–J	
  =	
  CDR3	
  oblast	
  
Sanger	
  
+  dlouhé	
  ready	
  
+  nižší	
  chybovost	
  
-  porovnávání	
  délek	
  readů	
  
-  vysoká	
  cena	
  
-  nízké	
  rozlišení	
  
NGS	
  (Illumina	
  GAII	
  Analyzer)	
  
+  nízká	
  cena	
  
+  vysoké	
  rozlišení	
  
+  konkrétní	
  sekvence	
  
-  vyšší	
  chybovost	
  
-  krátké	
  ready	
  (nutná	
  rekonstrukce)	
  
TCR	
  (T-­‐cell	
  receptor)	
  
•  vysoká	
  variabilita	
  –	
  až	
  1018	
  klonotypů	
  (alespoň	
  107)	
  
•  V–(D)–J	
  =	
  CDR3	
  oblast	
  
Sanger	
  
+  dlouhé	
  ready	
  
+  nižší	
  chybovost	
  
-  porovnávání	
  délek	
  readů	
  
-  vysoká	
  cena	
  
-  nízké	
  rozlišení	
  
NGS	
  (Illumina	
  GAII	
  Analyzer)	
  
+  nízká	
  cena	
  
+  vysoké	
  rozlišení	
  
+  konkrétní	
  sekvence	
  
-  vyšší	
  chybovost	
  
-  krátké	
  ready	
  (nutná	
  rekonstrukce)	
  
iSSAKE	
  (immuno-­‐SSAKE)	
  
•  nový	
  sekvenační	
  přístup	
  a	
  socware	
  
•  kompilace	
  krátkých	
  readů	
  z	
  paralelního	
  
sekvenování	
  
•  profilování	
  metagenomů	
  T-­‐buněk	
  
(SSAKE	
  =	
  Short	
  Sequence	
  Assembly	
  by	
  progressive	
  K-­‐mer	
  search	
  
and	
  30	
  read	
  Extension	
  (Warren	
  et	
  al.,	
  2007))	
  
	
  
Vstupní	
  parametry	
  
•  -­‐f	
  	
  Fasta	
  file	
  containing	
  all	
  the	
  [paired	
  (-­‐p	
  1)	
  /	
  unpaired	
  (-­‐p	
  0)]	
  reads	
  (required)	
  
•  	
   !	
  paired	
  reads	
  must	
  now	
  be	
  separated	
  by	
  ":"	
  
•  -­‐s	
  	
  Fasta	
  file	
  containing	
  sequences	
  to	
  use	
  as	
  seeds	
  exclusively	
  (specify	
  only	
  if	
  different	
  from	
  read	
  set,	
  op5onal)	
  
•  -­‐m	
  	
  Minimum	
  number	
  of	
  overlapping	
  bases	
  with	
  the	
  seed/con5g	
  during	
  overhang	
  consensus	
  build	
  up	
  (default	
  -­‐m	
  
15)	
  
•  -­‐o	
  	
  Minimum	
  number	
  of	
  reads	
  needed	
  to	
  call	
  a	
  base	
  during	
  an	
  extension	
  (default	
  -­‐o	
  2)	
  
•  -­‐r	
  	
  Minimum	
  base	
  ra5o	
  used	
  to	
  accept	
  a	
  overhang	
  consensus	
  base	
  (default	
  -­‐r	
  0.7)	
  
•  -­‐t	
  	
  Trim	
  up	
  to	
  -­‐t	
  base(s)	
  on	
  the	
  con5g	
  end	
  when	
  all	
  possibili5es	
  have	
  been	
  exhausted	
  for	
  an	
  extension	
  (default	
  -­‐t	
  
0)>	
  
•  -­‐c	
  	
  Track	
  base	
  coverage	
  for	
  each	
  con5g	
  (op5onal)	
  
•  -­‐b	
  	
  Base	
  name	
  for	
  your	
  output	
  files	
  (op5onal)	
  
•  -­‐z	
  	
  Minimum	
  con5g	
  size	
  to	
  track	
  base	
  coverage	
  and	
  read	
  posi5on	
  (default	
  -­‐z	
  50,	
  op5onal)	
  
•  -­‐p	
  	
  Paired-­‐end	
  reads	
  used?	
  (-­‐p	
  1=yes,	
  -­‐p	
  0=no,	
  default	
  -­‐p	
  0)	
  
•  -­‐v	
  	
  Runs	
  in	
  verbose	
  mode	
  (-­‐v	
  1=yes,	
  -­‐v	
  0=no,	
  default	
  -­‐v	
  0,	
  op5onal)	
  
•  ============	
  Op5ons	
  below	
  only	
  considered	
  with	
  -­‐p	
  1	
  ============	
  
•  -­‐d	
  	
  Mean	
  distance	
  expected/observed	
  between	
  paired-­‐end	
  reads	
  (default	
  -­‐d	
  200,	
  op5onal)	
  
•  -­‐e	
  	
  Error	
  (%)	
  allowed	
  on	
  mean	
  distance	
  	
  	
  e.g.	
  -­‐e	
  0.75	
  	
  ==	
  distance	
  +/-­‐	
  75%	
  (default	
  -­‐e	
  0.75,	
  op5onal)	
  
•  -­‐k	
  	
  Minimum	
  number	
  of	
  links	
  (read	
  pairs)	
  to	
  compute	
  scaffold	
  (default	
  -­‐k	
  2,	
  op5onal)	
  
•  -­‐a	
  	
  Maximum	
  link	
  ra5o	
  between	
  two	
  best	
  con5g	
  pairs	
  *higher	
  values	
  lead	
  to	
  least	
  accurate	
  scaffolding*	
  (default	
  -­‐a	
  
0.7,	
  op5onal)	
  
•  -­‐g	
  	
  Fasta	
  file	
  containing	
  unpaired	
  sequence	
  reads	
  (op5onal)	
  
Skládání	
  sekvencí	
  
•  vysoký	
  překryv	
  v	
  oblas5	
  V,	
  J	
  a	
  C	
  
•  vysoký	
  počet	
  jedinečných	
  sekvencí	
  v	
  CDR3	
  
•  využívání	
  anotovaných	
  oblasz	
  V	
  (3’)	
  a	
  J	
  (5’)	
  
pro	
  začátky	
  skládání	
  
•  přidání	
  náhodné	
  báze	
  do	
  V–D–J	
  spojení	
  
•  delece	
  báze	
  na	
  3ʹ′	
  V	
  
•  delece	
  báze	
  na	
  5ʹ′	
  J	
  
Testovací	
  soubor	
  
•  Genbank	
  TCRβ	
  mRNA	
  
•  N	
  =	
  1	
  000	
  000	
  
•  36,	
  42	
  nebo	
  50	
  nukleo5dů	
  dlouhé	
  ready	
  
prak5cká	
  ukázka	
  
Děkuji	
  za	
  pozornost.