Enzymy
Co jsou to enzymy? – pozoruhodné chemické
katalyzátory
• Vyšší reakční rychlost (6- 12 řádů)
• Mírnější podmínky reakce (nižší teplota, atmosférický tlak, neutrální pH)
• Vyšší specifita reakce (specifické produkty, „nejsou“ vedlejší produkty)
• Schopnost regulace (allosterická regulace, kovalentní modifikace, variabilita)
Chemické
• Homogenní – reaktanty a katalyzátor jsou v systému přítomny ve stejné fázi.
• Heterogenní – nejčastěji je katalyzátor pevný a reaktanty jsou plynné. Tento typ
katalýzy se často používá v průmyslu (odpadá problém oddělování katalyzátoru
z reakční směsi).
Enzymy
Proteiny (mohou být také RNA molekuly – např. Ribosom), které slouží jako biologické
katalyzátory. V popisu chemické reakce s katalyzátorem používáme pojmy:
S + E ES P + E
Substrát (S): Jde o molekuly, které do reakce vstupují
Produkt (P): Jde o molekuly, které vznikají katalyzovanou reakcí
Enzym (E)
Komplex enzymu se substrátem (SE)
Katalyzátor je látka, která zvyšuje efektivitu
chemické reakce. Katalyzátor z reakce vystupuje
nezměněn. Ale v jejím průběhu vytváří
energeticky méně stabilní molekuly meziprodukty.
Díky meziproduktům je energie
potřebná pro vznik produktů rozdělena do více
částí (s menší energetickou náročností).
Energie potřebná k průběhu reakce se nazývá
aktivační energie. Snížení aktivační energie
umožňuje reakci za mírnějších podmínek (tzn. za
nižší teploty, tlaku).
Enzymy snižují aktivační bariéru. To je umožněno
díky vzniku meziproduktů, ve kterých jsou
rozrušeny staré vazby a naopak vznikají nové.
Meziprodukt je značen jako komplex enzymsubstrát
(ES).
Enzym jako katalyzátor
Enzymy se od chemických katalyzátoru liší:
●Efektivitou (enzymatické reakce bývají mnohem účinnější než chemické)
●Např. je enzym Orotinmonofosfát-dekarboxyláza (enzym odbourávající CO2 z molekul,
důležitý pro syntézu nukleových kyselin. Reakce samotná by zabrala miliony let, s enzymem
je to otázkou milisekund). (OMP – prekurzor pyrimidinových nukleotidů. Dekarboxylací orotidinmonofosfátu)
●Podmínkami (podmínky enzymatické reakce jsou dány okolním prostředí v organizmu)
●Aktivita enzymu je silně závislá na pH a teplotě prostředí.
●Vysoká specificita (enzymy často rozeznávají pouze jednu specifickou molekulu)
●Nezávislost na množství produktu (Chemická katalýza je přímo závislá na množství
substrátu, tzn. kolik substrátu do reakce dáme, tolik bude produktu. Enzymy jsou často
regulovány a tak může dojít k situaci, že i za přítomnosti substrátu nedojde k reakci).
Enzym jako katalyzátor
Enzymy jsou většinou proteiny, které se mohou nacházet samostatně nebo fungují pouze v
proteinových komplexech. Pro specificitu enzymové reakce je klíčová jeho 3D struktura.
Správné uspořádání aminokyselin je důležité pro funkčnost tzv. aktivního místa. To lze
rozdělit na katalytické a vazebné místo. Katalytické místo je oblast skládající se z několika
aminokyselin, ve které dochází ke katalytické reakci.
Enzymy - struktura
Katalytické místo je v proteinu obklopené vazebným místem. Vazebné místo funguje jako
přistávací dráha pro substrát. Navíc prostorově substrát polohuje do správné pozice nutné pro
katalýzu. Substrát a enzym musí být k sobě geometricky komplementární (jako zámek a klíč).
Vazebné místo reguluje enzymovou aktivitu změnami afinity a polohování substrátu do
katalytického místa.
Před enzymatickou reakcí je potřeba aby se do aktivního místa navázal substrát. Tomu
napomáhá vazebné místo. Vazebné místo navíc zajišťuje specificitu enzymu - vazbu
konkrétní molekuly, proteinu nebo skupiny proteinů.
Specificita je zachována díky:
Komplementárnímu tvaru vazebného místa a substrátu
Rozložení elektrochemického náboje
Hydrofobním nebo hydrofilním interakcím
Model zámku a klíče
Aktivní místo není strukturně rigidní a může se strukturně měnit po přijetí substrátu. V
některých případech dochází navíc ke změně tvaru substrátu napomáhající katalytické
reakci.
Enzymy – vazba substrátu
Katalytická reakce může probíhat
a) Stabilizací meziproduktu
V místě proteinu díky blízkým AMK zbytkům
dochází k výměně náboje s meziproduktem
(který by byl velice nestabilní ve volném
prostředí).
b) Dočasnou interakcí se substrátem
Enzym se stane příjemcem aktivní skupiny,
umožňující snadnější přesun na jiné místo
substrátu nebo jiný substrát
c) Změna konformace molekuly
Změnou struktury molekuly dochází také ke
snížení energie potřebné pro vznik produktu.
Enzymy – aktivní místo
U některých enzymů se katalytické reakce neúčastí jenom zbytky aminokyselin, ale i jiné,
pomocné molekuly - těmto molekulám říkáme kofaktory.
Pokud je takový kofaktor vázán kovalentní vazbou k enzymu - nazýváme jej prostetickou
skupinou. Pokud je vazba v katalytickém místě méně pevná jako v případě iontů kovů
nebo organických molekul jedná se o koenzym.
Mezi kofaktory patří například vitamíny rozpustné ve vodě (např. B1,B2, B6, B12, C atd.)
Katalyticky aktivní dvojice kofaktoru a enzymu se nazývá holoenzym. Naopak enzym bez
kofaktoru je apoenzym.
Enzymy - kofaktory
Jak se v enzymech orientovat?
Enzymy mají svoje specifické názvosloví.
Název enzymu se skládá buďto z označení substrátu nebo z označení substrátu + typ dané
katalytické reakce. Příponou názvu je - asa.
Př. proteinasa, alkoholdehydrogenasa.
V názvu tedy máme jak vstupní substrát, tak i typ reakce a můžeme usuzovat jaký produkt
vznikne.
Enzymy - názvosloví
Pro podrobnější klasifikaci se využívá IUBMB (INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY
AND MOLECULAR BIOLOGY) enzymová nomenklatura. V ní jsou enzymy rozděleny do 6
hlavních tříd podle typu reakce, kterou katalyzují.
• oxidoreduktasy (katalysují intermolekulární oxidačně-redukční reakce, např. ethanol +
NAD+ → acetaldehyd + NADH + H+);
• transferasy (přenos chemických skupin z molekuly donoru na akceptor, např. ATP +
glukosa → glukosa-6-fosfát + ADP);
• hydrolasy (štěpení vazeb vodou, např. sacharosa + H2O → glukosa + fruktosa);
• lyasy (nejčastěji adice na dvojnou vazbu nebo eliminace za vzniku dvojné vazby, např.
hydratace fumarátu v citrátovém cyklu -OOC-CH=CH-COO- + H2O → -OOC-CH(OH)-
CH2-COO-);
• isomerasy (isomerace, např. D-glukosa → D-fruktosa nebo L-alanin → D-alanin);
• ligasy (spojení dvou molekul, k němuž se dodává energii štěpením ATP nebo GTP,
např. karboxylace pyruvátu na oxalacetát CH3-CO-COO- + CO2 + ATP + H2O → OOC-CH2-CO-COO-
+ ADP + Pi).
např. EC 1.1.1.1 znamená
(EC) - Enzyme commision
(1, hlavní třída) - oxidoreduktázy (v reakci dochází k výměně elektronů)
(1, podtřída) - reakce probíhá na C-OH skupině
(1, podskupina) - kofaktor - zde NAD nebo NADP
(1, pořadové číslo) - určuje již konkrétní enzym - alkoholdehydrogenazu
Enzymová kinetika je studium enzymatických reakcí. Studuje efektivitu a nejvhodnější
podmínky pro enzymatickou reakci.
Enzymová kinetika
Jaká je kinetika enzymatické reakce?
Pro jeden substrát je rychlost enzymatické reakce definována rychlostí jakou se substrát
váže na enzym a rychlostí jakou dochází k tvorbě produktu.
Při nízké koncentraci substrátu vůči enzymu je reakce téměř přímo úměrná jeho
koncentraci, protože nic nebrání katalýze.
Druhým extrémem je vysoká koncentrace substrátu vůči enzymu. V takovém
případě jsou aktivní místa enzymu zaplněny a nedochází k vazbě s přebytečným substrátem.
V tomto případě je už celková rychlost reakce závislá na tom, jak rychle dokáže enzym
zpracovat substrát na produkt - tím uvolní aktivní místo pro další substrát.
Dříve se podle pravidel Mezinárodní biochemické unie (IUB) z r. 1961 užívalo pojmu
enzymová jednotka (U) pro takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 μmol
substrátu za minutu za standardních podmínek (tj. nasycení enzymu substrátem, udaná
teplota a pH).
Podle doporučení IUB z r. 1972 se však od pojmu množství enzymu upouští, protože tato
definice se nehodí pro enzymy, které dosud nebyly izolovány.
Namísto toho byly zavedeny pojmy: enzymová aktivita jako rychlost přeměny substrátu, která
se dá přičíst na vrub enzymové katalýze;
specifická aktivita jako enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek ke hmotnosti
(např. k určitému množství tkáně, séra, enzymového preparátu);
molová aktivita jako enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek k množství
enzymové substance (byl-li enzym již izolován), které je zpravidla vyjádřeno v molech. Převod
dosavadních enzymových jednotek (U) na kataly (kat) se řídí vztahem:
1 U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat
Avšak ve starší literatuře se ještě s pojmem enzymové jednotky (U) setkáváme. U nás byly
zavedeny kataly do klinicko-biochemické laboratorní praxe povinně a výsledky laboratorních
vyšetřeni jsou takto vyjadřovány v séru nejčastěji jako μkat/l.
Graf ukazuje, že na začátku je rychlost reakce závislá na vazbě E se S, poté se enzym
nasytí a poté přebírá důležitost krok přeměny ES na P.
Enzymová kinetika je studium enzymatických reakcí. Studuje efektivitu a nejvhodnější
podmínky pro enzymatickou reakci.
Základní enzymatická reakce probíhá touto rovnicí:
kde (E) je enzym, (S) substrát, (ES) komplex enzym-substrát, (P) produkt
k1, k2 jsou rychlostní konstanty, ty popisují rychlost dané reakce. k-1 je rychlostní konstanta
rozpadu komplexu ES. Rychlostní konstanta je rovna rychlosti reakce při jednotkových
koncentracích výchozích látek.
Za předpokladu, že žádný produkt neinteraguje zpětně s enzymem za vzniku ES, lze
rychlost enzymatické reakce v (mol.s-1
) definovat jako:
V = k2 [ES]
Enzymová kinetika
Problém je, že ES je neměřitelný. Rychlost reakce se proto definuje podle koncentraci látek o
kterých víme jejich koncentraci. Rozdělíme si vznik ES do dvou rovnic:
a) vzniku produktu: [ES] = k1 [E] [S]
b) rozpadu komplexu ES směrem k S nebo P: [ES] = (k-1 + k2) [ES]
Za předpokladu, že je v reakci enzym plně nasycen – tzn. Koncentrace ES je stále stejná:
K1.[E].[S] = (k-1 + k2).[ES] a dále
Koncentrace substrátu mezi nesaturovaným a saturovaným stavem enzymu je definována
pomocí Michaelisovy konstanty KM –konstanta poloviční saturace - ta se rovná koncentraci
substrátu, při které došlo k polovičnímu nasycení enzymu substrátem a reakční rychlost a
je rovna polovině maximální rychlosti.
Z rovnice enzymatické katalýzy lze KM vyjádřit jako:
Po dosazení do předchozí rovnice dostáváme:
Za předpokladu, že koncentrace E v reakci je mnohonásobně menší než S ([E] << [S]), je
[ES] + [S] ≈ [S].
Koncentrace volného enzymu lze definovat jako rozdíl celkového enzymu a ES:
[E] = [Eo] – [ES]
Po dosazení do rovnice dostáváme:
Po vyjádření [ES] dostáváme:
Víme už, že rychlost je definovaná jako: V = k2 [ES]
Po dosazení dostaneme:
Je těžké experimentálně sledovat momentální rychlost enzymatické reakce. Proto se sleduje
rychlost maximální Vmax. Vmax je definována rychlostí enzymatické reakce při plné saturaci
enzymu (po ní je rychlost stabilní, lze ji pozorovat). Této rychlosti dosáhneme při [S] >>KM.
Pak [S]/([S]+KM) ≈ 1
Vmax následně definujeme z předchozí rovnice:
Následně dostáváme finální rovnici, ve které lze rychlost enzymatické rovnic získat měřením
pozorovatelných veličin.
Tato rovnice je známá jako Rovnice Michaelis-Mentenové:
Rovnice Michaelis-Mentenové
Pro kinetiku enzymatické reakce s jedním substrátem. Tzn. Že do katalytického místa vstupuje
pouze jedna molekula, která interaguje s enzymem.
v0 je počáteční rychlost enzymatické reakce, Vmax je limitní hodnota rychlosti při plném
nasycení enzymu substrátem, [S] koncentrace substrátu, KM je Michaelisova konstanta.
Pokud má enzym nízké KM, znamená to, že může dosahovat maximální rychlosti při nízké
koncentraci substrátu. Enzymy s KM při 10-8
– 10-10
M-1
.s-1 – prakticky každý kontakt se
substrátem vede k přeměně na produkt.
Je třeba brát tuto rovnici pouze jako zjednodušenou. Nezohledňuje další faktory, které
v reakci mohou nastat jako:
●inhibici reakce produktem
●zvratná reakce v meziproduktem
●nepopisuje allosterické chování proteinů (tedy že konformační změna proteinu může
ovlivnit enzymatickou aktivitu)
●kooperativní interakce
Navíc je platná za předpokladu, kdy:
Koncentrace ES se mění mnohem pomaleji než koncentrace P a S.
Koncentrace enzymu se v čase nemění.
Rovnice Michaelis-Mentenové
Kinetika v takových reakcí navíc sleduje v jakém pořadí dochází k vazbě S na E.
Bi-Bi reakce
Multisubstrátové enzymatické
reakce
Oba substráty se vážou na enzym v jednom okamžiku a
vyváří ternární EAB komplex.
Může probíhat náhodným mechanismem - nezáleží na pořadí
ve kterém se substráty navážou. V uspořádaném mechanismu
je definováno a záleží na tom který substrát do aktivního místa
přistupuje jako první, druhý atd.
Bi-Bi mechanismus využívá například DNA Polymeráza.
Ping-Pong mechanismus enzymové reakce
Enzym má dva stavy - základní a intermediární. V intermediárním stavu je enzym
chemicky modifikován prvním substrátem.
A - substrát umožňující přenos chemické skupina na enzym a po jejím vypuštění dochází
k vazbě B, na který je chemické skupina z enzymu přenesena.
Př. mohou být enzymy využívající kofaktory.
Multisubstrátové enzymatické
reakce
Dochází ke kooperativní vazbě substrátu.
Kinetika rozdílná oproti Michaelis-Mentenové. Struktura allosterických enzymů může být
pozměněna vazbou allosterických efektorů do allosterického místa. Allosterické místo se
nachází mimo aktivního místa. Efektory mohou změnit konformaci vazebného nebo
aktivního místa enzymu vedoucí jak k aktivaci tak inhibici enzymatických procesů.
Křivka závislosti koncentrace substrátu na rychlosti reakce je sigmoidní (jak známe např. z
hemoglobinu). Kooperativní interakce jsou u enzymů běžné. Umožňuji regulovat jejich funkci
na základě koncentrace substrátu nebo produktů.
Například při pozitivní regulaci mohou být více citlivé na nízkou koncentraci S, v negativní
naopak necitlivé.
Kinetika allosterických enzymůallosterický – charakterizovaný odlišným prostorovým sterickým uspořádáním
Inhibitory jsou molekuly, které redukují nebo blokují enzymatickou aktivitu. Inhibitor může
bránit vazbě k aktivnímu místu enzymu nebo zabránit katalytické reakci. Naopak
aktivátory enzymatickou aktivitu zvyšují.
Inhibice může být vrátný nebo nevratný proces.
Irreverzibilní inhibitory - vytváří kovalentní (pevnou) vazbu na inhibitor. Dochází k
chemické modifikaci zbytků AMK potřebné pro enzymatickou aktivitu.
Reverzibilní - vazba je nekovalentní (vodíkový můstek, hydrofobní interakce, iontová
vazba).
Enzymová inhibice
V kinetice inhibiční reakce sledujeme primárně specificitu inhibitoru a také jeho účinnost.
Inhibice enzymů
působení mnoha léků je založeno na inhibici specifických enzymů metabolických drah tyto léky jsou
analoga substrátů - mají podobnou strukturu jako substráty, ale nejsou enzymem přeměňovány (např.
methotrexát, strukturní analog folátu /= koenzym/, soutěží s tímto koenzymem o vazbu do aktivního centra
enzymu podílejícího se na syntéze thymidin monofosfátu ® pokles syntézy DNA vede k poklesu
buněčného dělení nádorových buněk)
Existují tři hlavní skupiny inhibitorů:
1) kompetitivní inhibitory
· strukturou podobné substrátu
· enzym nekatalyzuje přeměnu inhibitoru, inhibitor se pouze na enzym naváže
· váží se do vazebného místa substrátu (soutěží se substrátem o vazebné místo)
· zvýšením koncentrace substrátu lze inhibici potlačit
· Km se v přítomnosti inhibitoru zdánlivě zvyšuje
· V max se nemění
2) nekompetitivní inhibitory
· nebrání vazbě substrátu na enzym
· váží se mimo vazebné místo substrátu
· inhibici nelze potlačit zvýšením koncentrace substrátu, lze ji snížit pouze odstraněním inhibitoru
dialýzou (inhibitor se neváže kovalentně)
· žádný z komplexů enzym-inhibitor (E-I ani E-I-S) není katalyticky aktivní ® snížení koncentrace
aktivního enzymu _ pokles Vmax
· Km se nemění
3) akompetitivní inhibitory
· váží se pouze na komplex enzym-substrát
· dochází ke zdánlivé změně Km i Vmax
Neurotoxin je druh jedu, který působí na nervovou soustavu. Produkují ho jedové žlázy většiny
korálovcovitých hadů žijících na souši (kobry, korálovci, mamby,…).
Myotoxin je jed působící na svalovinu. V jedových žlázách ho mají všechny mořské druhy
korálovcovitých hadů (vodnáři, vlnožilové) a některé suchozemské druhy korálovcovitých hadů
žijících v Austrálii.
• Většina živočišných buněk má vysokou koncentraci K+ uvnitř buněk a nízkou Na+ ve vztahu k
vnějšímu prostředí.
• Takový iontový gradient je generován specifickým transportním systémem, enzymem s názvem
Na+- K+ pumpa nebo také
• Na+- K+ ATPasa.
• Hydrolýza ATP pumpou poskytuje energii potřebnou k aktivnímu transportu Na+ ven z buňky a K+
dovnitř, za účelem tvorby gradientu. Název Na+- K+ ATPasa je používán proto, že k hydrolýze ATP
dochází pouze za situace, kdy jsou oba ionty na pumpu vázány.
• Enzym vyžaduje přítomnost Mg2+ iontů. Aktivní transport je má velmi významný fyziologický
efekt. Na tvorbu gradientu se spotřebuje více než třetina vytvořeného ATP při odpočinku
organismu.
• Gradient obou iontů kontroluje objem buňky, udržuje neurony a svalové buňky v elektricky
excitovaném stavu a pohání aktivní transport sacharidů a aminokyselin.
Hemotoxin je druh jedu, který rozkládá krevní buňky uštknuté kořisti. Produkují ho jedové žlázy druhů
hadů z čeledi zmijovitých (zmije, chřestýši, ploskolebci apod.).
Složky jedů ovlivňující hemokoagulaci
Toxiny a enzymy ovlivňující funkci hemokoagulačního systému mají vliv na funkci krevních destiček i endotelu.
Hemokoagulační aktivní toxiny mají na svědomí nejvíce fatálních případů intoxikace hadími jedy na světě. Klinicky se
účinek projeví krvácením, avšak může dojít až k neztišenému krvácení z traumat, sliznic a do orgánů, smrt tedy končí
poruchami typu diseminované intravaskulární koagulopatie. Tyto toxiny jsou charakteristické pro bojgy, zmije,
korálovcovité a mořské hady. Hemostáza je ovlivněna zásahem toxinů do různých struktur hemokoagulačního
systému.
Toxiny mohou působit na tyto systémy:
Krevní destičky
Zásah toxinu je většinou do povrchních aktivačních struktur destiček. Enzymy typu fibrinogenáza, nukleotidáza, PLA2
mohou způsobit inhibici agregace krevních destiček. (Valenta 2008)
Kontaktní cesta aktivace hemokoagulace
Aktivace protrombinu
Zvýšení trombinové aktivity je způsobena aktivací koagulačních faktorů, nebo přímým zásahem do molekuly
protrombinu. Dochází ke krvácení typu diseminované intravaskulární koagulopatie. Další z typů enzymů, je enzym
serinové protézy, účinkující se spoluúčastí fosfolipidů a Ca2+.
Konvertující fibrinogen na fibrin
Enzymy hadích jedů způsobují odštěpování fibrinopeptidů (fibrinopeptid A) z molekul fibrinogenu, a tak způsobují
konverzi fibrinogenu na fibrin
Degradující fibrinogen na fibrin
Jedná se o enzymatické působení proteináz na fibrinogen nebo fibrin. Mohli bychom je také nazvat
Fibrino(geno)lytické aktivity hadích jedů. Působením těchto látek vzniká zvýšené krvácení z ran a obraz
hypofibrinogenémie nebo afibrinogenémie.
Inaktivace antitrombinu
Aktivace C proteinu
Kompetitivní reverzibilní inhibice
Kde I je inhibitor.
S a I se mohou vázat na enzym ve stejném
čase. Inhibitor je často strukturálně velmi
podobný substrátu, ale nedochází u něj k
enzymatické reakci. I se tedy váže na
vazebné (i aktivní) místo enzymu. O tyto
místo tedy S a I soupeří.
Reverzibilní Enzymové inhibice
Pokud zvýšíme koncentraci S, bude docházet k častějším interakcím mezi E a S a
inhibiční účinek bude potlačen.
Po inhibici kompetitivním inhibitorem dochází k zvýšení KM (Protože inhibitor obsazuje
část molekul enzymu, pro vytvoření komplexu enzym-substrát je tedy k dispozici jen
málo molekul volného enzymu. Z tohoto důvodu je reakce pomalá). Vmax se nemění.
Akompetivní reverzibilní inhibice
Inhibitor se může vázat na jiné místo enzymu (a to pouze v případě, kdy je substrát vázaný
na enzym). Po vazbě dochází k změně struktury enzymu vedoucí ke znemožnění
enzymatické reakce.
Reverzibilní Enzymové inhibice
Zde se inhibitor váže pouze na ES. Pro inhibici
tedy potřebuje přítomnost substrátu. S rostoucí
koncentrací substrátu vede k zvýšené inhibice
enzymu. Proto dochází ke snížení Vmax. Tím se
snižuje se také i KM.
Smíšená reverzibilní inhibice
Inhibitor se váže na aktivní místo enzymu nezávisle
na tom, zdali je aktivní místo prázdné nebo je S v
komplexu s enzymem. Nicméně má větší afinitu k
jednomu nebo druhému stavu. Jedná se o mix
kompetitivní a akompetitivní inhibice.
Vazba inhibitoru ovlivňuje vazbu S (zvyšuje se KM) a
zároveň snižuje počet aktivních molekul enzymu
(snížení Vmax).
Inhibiční efekt může být redukován, ale ne potlačen
zvýšenou koncentrací S.
Reverzibilní Enzymové inhibice
Nekompetivní reverzibilní inhibice
Specifický případ smíšené enzymové inhibice.
Inhibitor redukuje afinitu enzymu k substrátu, ale neovlivňuje jeho vazbu (S se tedy na
enzym neváže). Inhibitor se podobně jako u akompetitivní inhibice váže na jiné místo
proteinu a vyvolává strukturální změny v aktivním místě enzymu.
Reverzibilní Enzymové inhibice
Tento typ inhibice je přímo závislý na koncentraci I, ne na koncentraci S (protože se
Inhibitor váže na jiné místo enzymu a nesoupeří se substrátem). Takže když dojde k
inhibici 50% enzymu, tak jak při nízké i vysoké koncentraci substrátu.
Klesá Vmax, protože aktivita enzymu už je redukovaná a vysoká koncentrace S na ni nemá
efekt.
Ale KM zůstává stejná (mechanismus enzymatické reakce je stejný, ale s omezeným
množstvím aktivních enzymů).
Enzymy mohou být stabilní mezi teplotou 0 až
100°C (termofilní bakterie mají např. velmi
stabilní enzymy, které jsou aktivní i při 110°C). V
lidském těle jsou enzymy konstruovány na
teplotu okolo 37°C.
Enzymy jsou aktivní pouze v malém teplotním
intervalu. Teplota, při kterém je enzym nejvíce
aktivní - Teplotní optimim. To je umožněno
ideální stabilitou proteinu a správnému
uspořádání AMK v aktivním místě.
Vliv teploty na enzymatickou reakci
Vliv teploty na enzymatickou reakci
Závislost reakce na teplotě je v oblasti teplotního optima definováno Arheniovou
rovnicí, která definuje závislost jakékoliv chemické reakce na teplotě. S rostoucí teplotou
získávají molekuly (S i E) větší kinetickou energii a narůstá pravděpodobnost ideální
srážky mezi S a E. Při nízkých teplotách je sice enzym stabilní a není ovlivněna struktura
proteinu, ale počet srážek je omezený.
Při vyšších teplotách pak dochází k částečné nebo úplné denaturaci (rozpadu 3D
struktury a tvorbě neuspořádaných proteinových klubek) a degradaci proteinu.
Vliv pH na enzymatickou reakci
pH optimum závisí na funkci a prostředí
ve kterém se protein vyskytuje.
pH 7 - trypsin, enzymy v krvi
pH 2 - pepsin
pH 10 – Arginasa
Záleží na AMK zbytcích v aktivním místě,
protože katalytická aktivita enzymů se
odvíjí od toho zda jsou AMK ionizované.
Také dochází k narušení elektrochemické
interakce mezi vazebným místem a
substrátem.
Vysoké a nízké pH denaturuje
proteinovou strukturu.
Enzymy
Ing. Lívia Eiselleová, PhD.
Substrát (S) - molekuly, které do reakce vstupují
Produkt (P) - molekuly, které vznikají katalyzovanou reakcí
Enzym (E)
Komplex enzymu se substrátem (ES)
Proteiny (mohou být také RNA molekuly – např. ribosom), které slouží jako biologické
katalyzátory
Enzymy
E+S ES E+P
- vyšší reakční rychlost (6- 12 řádů)
- mírnější podmínky reakce (nižší teplota, atmosférický tlak, neutrální pH)
- vyšší specifita reakce (specifické produkty, „nejsou“ vedlejší produkty)
- schopnost regulace (allosterická regulace, kovalentní modifikace, variabilita)
Mohou být:
- homogenní – reaktanty a katalyzátor jsou v systému přítomny ve stejné fázi
- heterogenní – nejčastěji je katalyzátor pevný a reaktanty jsou plynné
Na co slouží enzymy
Jaké známe enzymy
Replikační enzymy
- podílejí sa na replikaci DNA
Restrikční enzymy
- sekvenčne specifické endonukleázy
Katalyzátor
- zvyšuje efektivitu chemické reakce
- z reakce vystupuje nezměněn
- v průběhu reakce vytváří energeticky méně stabilní molekuly – meziprodukty
Aktivační energie
- energie potřebná k průběhu reakce
- snížení aktivační energie umožňuje reakci za mírnějších podmínek (tzn. za nižší teploty,
tlaku).
Enzymy snižují aktivační bariéru - díky vzniku meziproduktů
Enzym jako katalyzátor
- efektivita (enzymatické reakce bývají
mnohem účinnější než chemické)
- podmínky (pH, teplota)
- vysoká specificita (enzymy často
rozeznávají pouze jednu specifickou
molekulu)
- nezávislost na množství produktu
(chemická katalýza je přímo závislá na
množství substrátu)
Enzymy se od chemických katalyzátorů liší
- proteiny, které se mohou nacházet
samostatně nebo v proteinových komplexech
- pro specificitu enzymové reakce je klíčová
jeho 3D struktura
- správné uspořádání aminokyselin je důležité
pro funkčnost tzv. aktivního místa
Aktivní místo:
Katalytické místo
- oblast skládající se z několika aminokyselin, ve
které dochází ke katalytické reakci
Vazebné místo
- funguje jako přistávací dráha pro substrát
- prostorově substrát polohuje do správné pozice
nutné pro katalýzu
- reguluje enzymovou aktivitu změnami afinity a
polohování substrátu do katalytického místa
Struktura enzymů
- do aktivního místa (zajišťuje vazebné místo)
- vazebné místo navíc zajišťuje specificitu enzymu
Specificita je zachována díky:
- komplementárnímu tvaru vazebného místa a substrátu
- rozložení elektrochemického náboje
- hydrofobním nebo hydrofilním interakcím
Vazba substrátu
Substrát a enzym musí být k sobě
geometricky komplementární (model
zámku a klíče)
Katalytická reakce může probíhat
a) stabilizací meziproduktu
- v místě proteinu díky blízkým AMK
zbytkům dochází k výměně náboje s
meziproduktem (ve stejném prostředí
by byl nestabilní)
b) dočasnou interakcí se substrátem
- enzym se stane příjemcem aktivní
skupiny, umožňující snadnější přesun na
jiné místo substrátu nebo jiný substrát
c) změna konformace molekuly
- změnou struktury molekuly dochází
také ke snížení energie potřebné pro
vznik produktu
Aktivní místo enzymu
- katalytické reakce se neúčastí jenom zbytky aminokyselin, ale i jiné molekuly –
kofaktory (např. vitamíny rozpustné v tucích, např. B1,B2, B6, B12, C atd.)
- pokud je kofaktor vázán kovalentní vazbou k enzymu - prostetická skupina
- pokud je vazba v katalytickém místě méně pevná jako v případě iontů kovů nebo
organických molekul jedná se o koenzym
Holoenzym - katalyticky aktivní dvojice kofaktoru a enzymu
Apoenzym - enzym bez kofaktoru
Enzymy - kofaktory
- enzymy mají svoje specifické názvosloví
- název enzymu se skládá buďto z označení substrátu nebo z označení substrátu + typ
dané katalytické reakce
- příponou názvu je – asa
- např. proteinasa, alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa
Nazvosloví enzymů
- podrobnější klasifikaci IUBMB (INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND
MOLECULAR BIOLOGY)
• oxidoreduktasy (katalysují intermolekulární oxidačně-redukční reakce, např. ethanol +
NAD+ → acetaldehyd + NADH + H+)
• transferasy (přenos chemických skupin z molekuly donoru na akceptor, např. ATP +
glukosa → glukosa-6-fosfát + ADP)
• hydrolasy (štěpení vazeb vodou, např. sacharosa + H2O → glukosa + fruktosa);
• lyasy (nejčastěji adice na dvojnou vazbu nebo eliminace za vzniku dvojné vazby, např.
hydratace fumarátu v citrátovém cyklu -OOC-CH=CH-COO- + H2O → -OOC-CH(OH)-CH2-
COO-)
• isomerasy (isomerace, např. D-glukosa → D-fruktosa nebo L-alanin → D-alanin);
• ligasy (spojení dvou molekul, k němuž se dodává energii štěpením ATP nebo GTP, např.
karboxylace pyruvátu na oxalacetát CH3-CO-COO- + CO2 + ATP + H2O → -OOC-CH2-COCOO-
+ ADP + Pi)
např. EC 1.1.1.1 znamená
(EC) - Enzyme commision
(1, hlavní třída) - oxidoreduktázy (v reakci dochází k výměně elektronů)
(1, podtřída) - reakce probíhá na C-OH skupině
(1, podskupina) - kofaktor - zde NAD nebo NADP
(1, pořadové číslo) - určuje již konkrétní enzym - alkoholdehydrogenazu
Klasifikace enzymů
- studuje efektivitu a nejvhodnější podmínky pro enzymatickou reakci
- rychlost enzymatické reakce definována rychlostí jakou se substrát váže na enzym a
rychlostí jakou dochází k tvorbě produktu
nízká koncentraci substrátu vůči enzymu
- reakce téměř přímo úměrná jeho koncentraci
vysoká koncentrace substrátu vůči enzymu
- aktivní místa enzymu jsou zaplněny a nedochází k vazbě s přebytečným substrátem
- celková rychlost reakce závislá na tom, jak rychle dokáže enzym zpracovat substrát na
produkt
Kinetika enzymů
Dříve se podle pravidel Mezinárodní biochemické unie (IUB) z r. 1961 užívalo pojmu
enzymová jednotka (U) pro takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 μmol
substrátu za minutu za standardních podmínek
Namísto toho byly zavedeny pojmy:
enzymová aktivita - rychlost přeměny substrátu
specifická aktivita - enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek ke hmotnosti
molová aktivita - enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek k množství
enzymovu vyjádřeno v molech
Převod dosavadních enzymových jednotek (U) na kataly (kat) se řídí vztahem:
1 U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat
U nás byly zavedeny kataly do klinicko-biochemické laboratorní praxe povinně a výsledky
laboratorních vyšetřeni jsou takto vyjadřovány v séru nejčastěji jako μkat/l.
Kinetika enzymů - jednotky
Enzymová kinetika
- studium enzymatických reakcí: efektivita a nejvhodnější podmínky
- základní enzymatická reakce se dá vyjádřit touto rovnicí:
k1, k2 – rychlostní konstanty, popisujú rychlost dané reakce
k-1 – rychlostní konstanta rozpadu komplexu ES
Rychlostní konstanta je rovna rychlosti reakce při jednotkových koncentracích látek
Za předpokladu, že žádny produkt neinteraguje zpětně s enzymem za vzniku ES, lze rychlost
enzymatické reakce V (mol*s-1) definovat jako:
V = k2 [ES]
Problém je, že ES je neměřitelný.
Rychlost reakce se proto definuje podle koncentraci látek o kterých víme jejich
koncentraci.
Rozdělíme si vznik ES do dvou rovnic:
a) vzniku produktu: [ES] = k1 [E] [S]
b) rozpadu komplexu ES směrem k S nebo P: [ES] = (k-1 + k2) [ES]
Za předpokladu, že je v reakci enzym plně nasycen – tzn. koncentrace ES je stále
stejná:
K1.[E].[S] = (k-1 + k2).[ES] a dále
Enzymová kinetika
Koncentrace substrátu mezi nesaturovaným a saturovaným stavem enzymu je
definována pomocí Michaelisovy konstanty KM - konstanta poloviční saturace
- rovná se koncentraci substrátu, při které došlo k polovičnímu nasycení enzymu
substrátem
- reakční rychlost a je rovna polovině maximální rychlosti
Z rovnice enzymatické katalýzy lze KM vyjádřit jako:
Po dosazení do předchozí rovnice dostáváme:
Kinetika enzymů – Michaelisova konstanta
Za předpokladu, že koncentrace E v reakci je mnohonásobně menší než S ([E] << [S]), je [ES]
+ [S] ≈ [S].
Koncentrace volného enzymu lze definovat jako rozdíl celkového enzymu a ES:
[E] = [Eo] – [ES]
Po dosazení do rovnice dostáváme:
Po vyjádření [ES] dostáváme:
Víme už, že rychlost je definovaná jako: V = k2 [ES]
Po dosazení dostaneme:
Kinetika enzymů – odvození rovnic
- experimentálně sledovat momentální rychlost enzymatické reakce je ťežké
- proto se sleduje rychlost maximální Vmax
- Vmax je definována rychlostí enzymatické reakce při plné saturaci enzymu (po ní je
rychlost stabilní, lze ji pozorovat). Této rychlosti dosáhneme při [S] >>KM. Pak
[S]/([S]+KM) ≈ 1
Vmax následně definujeme z předchozí rovnice:
Následně dostáváme finální rovnici, ve které lze rychlost enzymatické rovnic získat
měřením pozorovatelných veličin: rovnice Michaelis-Mentenové:
Kinetika enzymů – odvození rovnic
- platí pro kinetiku enzymatické reakce s jedním substrátem (do katalytického místa
vstupuje ouze jedna molekula, která interaguje s enzymem)
v0 je počáteční rychlost enzymatické reakce
Vmax je limitní hodnota rychlosti při plném nasycení enzymu substrátem
[S] koncentrace substrátu
KM je Michaelisova konstanta
Pokud má enzym nízké KM, znamená to, že může dosahovat maximální rychlosti při nízké
koncentraci substrátu
Enzymy s KM při 10-8 – 10-10 M-1.s-1 – prakticky každý kontakt se substrátem vede k
přeměně na produkt.
Rovnice Michaelis-Mentenové
Nezohledňuje další faktory, které v reakci mohou nastat:
- inhibice reakce produktem
- zvratná reakce v meziproduktem
- nepopisuje allosterické chování proteinů (tedy že konformační změna proteinu
může ovlivnit enzymatickou aktivitu)
- kooperativní interakce
Navíc je platná za předpokladu, kdy:
- koncentrace ES se mění mnohem pomaleji než koncentrace P a S
- koncentrace enzymu se v čase nemění.
Rovnice Michaelis-Mentenové
Kinetika v takových reakcí navíc sleduje v jakém pořadí dochází k vazbě S na E
Bi-Bi reakce
- oba substráty se vážou na enzym v jednom okamžiku a
vyváří ternární EAB komplex
- může probíhat náhodným mechanismem - nezáleží na
pořadí ve kterém se substráty navážou
Bi-Bi mechanismus využívá například DNA Polymeráza
Multisubstrátové enzymatické reakce
Ping-Pong mechanismus enzymové reakce:
Enzym má dva stavy:
základní a intermediární (chemicky modifikován prvním substrátem)
A - substrát umožňující přenos chemické skupina na enzym a po jejím vypuštění dochází
k vazbě B, na který je chemické skupina z enzymu přenesena
Př. mohou být enzymy využívající kofaktory
Multisubstrátové enzymatické reakce
- allosterický – charakterizovaný odlišným prostorovým sterickým uspořádáním
- dochází ke kooperativní vazbě substrátu
- kinetika rozdílná oproti Michaelis-Mentenové
- struktura allosterických enzymů může být pozměněna vazbou allosterických efektorů do
allosterického místa (allosterické místo se nachází mimo aktivního místa)
- efektory mohou změnit konformaci vazebného nebo aktivního místa enzymu vedoucí jak
k aktivaci tak inhibici enzymatických procesů
Kinetika allosterických enzymů
Inhibitory - molekuly, které redukují
nebo blokují enzymatickou aktivitu
Aktivátory - enzymatickou aktivitu
zvyšují
Irreverzibilní inhibitory
- vytváří kovalentní (pevnou) vazbu na
inhibitor
- dochází k chemické modifikaci zbytků
AMK potřebné pro enzymatickou
aktivitu
Reverzibilní inhibitory
- vazba je nekovalentní (vodíkový
můstek, hydrofobní interakce, iontová
vazba)
V kinetice inhibiční reakce sledujeme primárně specificitu inhibitoru a také jeho účinnost.
Inhibitory enzymů
1) kompetitivní inhibitory
· strukturou podobné substrátu
· enzym nekatalyzuje přeměnu inhibitoru, inhibitor se
pouze na enzym naváže
· váží se do vazebného místa substrátu
· zvýšením koncentrace substrátu lze inhibici potlačit
· Km se v přítomnosti inhibitoru zdánlivě zvyšuje
· V max se nemění
2) nekompetitivní inhibitory
· nebrání vazbě substrátu na enzym
· váží se mimo vazebné místo substrátu
· inhibici nelze potlačit zvýšením koncentrace substrátu,
lze ji snížit pouze odstraněním inhibitoru
dialýzou (inhibitor se neváže kovalentně)
· žádný z komplexů enzym-inhibitor (E-I ani E-I-S) není
katalyticky aktivní ® snížení koncentrace
aktivního enzymu _ pokles Vmax
· Km se nemění
3) akompetitivní inhibitory
· váží se pouze na komplex enzym-substrát
· dochází ke zdánlivé změně Km i Vmax
Inhibice enzymů
Kompetitivní reverzibilní inhibice
- S a I se mohou vázat na enzym ve
stejném čase
- inhibitor je často strukturálně velmi
podobný substrátu, ale nedochází u
něj k enzymatické reakci
- I se tedy váže na vazebné (i
aktivní) místo enzymu. O tyto místo
S a I soupeří (kompetice)
Reverzibilní enzymové inhibice
- pokud zvýšíme koncentraci S, bude docházet k častějším interakcím mezi E a S inhibiční
účinek bude potlačen
- dochází k zvýšení KM (inhibitor obsazuje část molekul enzymu, pro vytvoření komplexu
enzym-substrát je tedy k dispozici jen málo molekul volného enzymu – reakce je
pomalá)
- Vmax se nemění
Akompetivní reverzibilní inhibice
- inhibitor se může vázat na jiné místo
enzymu (a to pouze v případě, kdy je
substrát vázaný na enzym)
- po vazbě dochází k změně struktury
enzymu vedoucí ke znemožnění
enzymatické reakce
- inhibitor se váže pouze na ES
- pro inhibici tedy potřebuje přítomnost
substrátu
- s rostoucí koncentrací substrátu vede k
zvýšené inhibice enzymu
- dochází ke snížení Vmax, tím se snižuje se
také i KM.
Reverzibilní enzymové inhibice
Smíšená reverzibilní inhibice
- inhibitor se váže na aktivní místo
enzymu nezávisle na tom, zdali je
aktivní místo prázdné nebo je S v
komplexu s enzymem
- má větší afinitu k jednomu nebo
druhému stav - mix kompetitivní a
akompetitivní inhibice
- vazba inhibitoru ovlivňuje vazbu S
(zvyšuje se KM) a zároveň snižuje
počet aktivních molekul enzymu
(snížení Vmax)
- inhibiční efekt může být redukován,
ale ne potlačen zvýšenou
koncentrací S
Reverzibilní enzymové inhibice
- specifický případ smíšené
enzymové inhibice
- inhibitor redukuje afinitu enzymu k
substrátu, ale neovlivňuje jeho
vazbu (S se tedy na enzym
neváže)
- podobně jako u akompetitivní
inhibice váže na jiné místo
proteinu a vyvolává strukturální
změny v aktivním místě enzymu.
Reverzibilní enzymové inhibice
Nekompetitivní reverzibilní inhibice
- inhibice je přímo závislá na koncentraci I, ne na koncentraci S
- když dojde k inhibici 50% enzymu, tak jak při nízké i vysoké koncentraci substrátu
- Vmax klesá - aktivita enzymu už je redukovaná a vysoká koncentrace S na ni nemá efekt
- KM zůstává stejná (mechanismus enzymatické reakce je stejný, ale s omezeným
množstvím aktivních enzymů)
- enzymy mohou být stabilní mezi
teplotou 0 až 100°C
- termofilní bakterie mají např. velmi
stabilní enzymy, které jsou aktivní i
při 110°C
- v lidském těle jsou enzymy
konstruovány na teplotu okolo 37°C
- aktivní pouze v malém teplotním
intervalu
- teplota, při kterém je enzym nejvíce
aktivní - teplotní optimum
Vliv teploty na enzymatickou reakci
- závislost reakce na teplotě je v oblasti
teplotního optima definováno Arheniovou
rovnicí
- s rostoucí teplotou získávají molekuly (S i E)
větší kinetickou energii a narůstá
pravděpodobnost ideální srážky mezi S a E
- při nízkých teplotách je sice enzym stabilní a
není ovlivněna struktura proteinu, ale počet
srážek je omezený
- při vyšších teplotách pak dochází k částečné
nebo úplné denaturaci (rozpadu 3D struktury
a tvorbě neuspořádaných proteinových
klubek) a degradaci proteinu
Vliv teploty na enzymatickou reakci
Vliv pH na enzymatickou reakci
- pH optimum závisí na funkci a prostředí, ve
kterém se protein vyskytuje
- záleží na AMK zbytcích v aktivním místě
- katalytická aktivita enzymů se odvíjí od toho
zda jsou AMK ionizované
- vysoké a nízké pH denaturuje proteinovou
strukturu
pH 7 – trypsin, enzymy v krvi
pH2 – pepsin
pH10 -arginasa
Děkuji za pozornost
Lívia Eiselleová
eiselle@med.muni.cz