Enzymy
3/12
Substrát (S) - molekuly, které do reakce vstupují
Produkt (P) - molekuly, které vznikají katalyzovanou reakcí
Enzym (E)
Komplex enzymu se substrátem (ES)
Proteiny (mohou být také RNA molekuly – např. ribosom), které slouží jako biologické
katalyzátory
Enzymy
E+S ES E+P
- vyšší reakční rychlost (6- 12 řádů)
- mírnější podmínky reakce (nižší teplota, atmosférický tlak, neutrální pH)
- vyšší specifita reakce (specifické produkty, „nejsou“ vedlejší produkty)
- schopnost regulace (allosterická regulace, kovalentní modifikace, variabilita)
Mohou být:
- homogenní – reaktanty a katalyzátor jsou v systému přítomny ve stejné fázi
- heterogenní – nejčastěji je katalyzátor pevný a reaktanty jsou plynné
Na co slouží enzymy
Jaké známe enzymy
Replikační enzymy
- podílejí sa na replikaci DNA
Restrikční enzymy
- sekvenčne specifické endonukleázy, využití v genetickém inženířství
Katalyzátor
- zvyšuje efektivitu chemické reakce
- z reakce vystupuje nezměněn
- v průběhu reakce vytváří energeticky méně stabilní molekuly – meziprodukty
Aktivační energie
- energie potřebná k průběhu reakce
- snížení aktivační energie umožňuje reakci za mírnějších podmínek (tzn. za nižší teploty,
tlaku).
Enzymy snižují aktivační bariéru - díky vzniku meziproduktů
Enzym jako katalyzátor
- efektivita (enzymatické reakce bývají
mnohem účinnější než chemické)
- podmínky (pH, teplota)
- vysoká specificita (enzymy často
rozeznávají pouze jednu specifickou
molekulu)
- nezávislost na množství produktu
(chemická katalýza je přímo závislá na
množství substrátu)
Enzymy se od chemických katalyzátorů liší
- proteiny, které se mohou nacházet
samostatně nebo v proteinových komplexech
- pro specificitu enzymové reakce je klíčová
jeho 3D struktura
- správné uspořádání aminokyselin je důležité
pro funkčnost tzv. aktivního místa
Aktivní místo:
Katalytické místo
- oblast skládající se z několika aminokyselin, ve
které dochází ke katalytické reakci
Vazebné místo
- funguje jako přistávací dráha pro substrát
- prostorově substrát polohuje do správné pozice
nutné pro katalýzu
- reguluje enzymovou aktivitu změnami afinity a
polohování substrátu do katalytického místa
Struktura enzymů
- do aktivního místa (zajišťuje vazebné místo)
- vazebné místo navíc zajišťuje specificitu enzymu
Specificita je zachována díky:
- komplementárnímu tvaru vazebného místa a substrátu
- rozložení elektrochemického náboje
- hydrofobním nebo hydrofilním interakcím
Vazba substrátu
Substrát a enzym musí být k sobě
geometricky komplementární (model
zámku a klíče)
Katalytická reakce může probíhat
a) stabilizací meziproduktu
- v místě proteinu díky blízkým AMK
zbytkům dochází k výměně náboje s
meziproduktem (ve stejném prostředí
by byl nestabilní)
b) dočasnou interakcí se substrátem
- enzym se stane příjemcem aktivní
skupiny, umožňující snadnější přesun na
jiné místo substrátu nebo jiný substrát
c) změna konformace molekuly
- změnou struktury molekuly dochází
také ke snížení energie potřebné pro
vznik produktu
Aktivní místo enzymu
- katalytické reakce se neúčastí jenom zbytky aminokyselin, ale i jiné molekuly –
kofaktory (např. vitamíny rozpustné v tucích, např. B1,B2, B6, B12, C atd.)
- pokud je kofaktor vázán kovalentní vazbou k enzymu - prostetická skupina
- pokud je vazba v katalytickém místě méně pevná jako v případě iontů kovů nebo
organických molekul jedná se o koenzym
Holoenzym - katalyticky aktivní dvojice kofaktoru a enzymu
Apoenzym - enzym bez kofaktoru
Enzymy - kofaktory
- enzymy mají svoje specifické názvosloví
- název enzymu se skládá buďto z označení substrátu nebo z označení substrátu + typ
dané katalytické reakce
- příponou názvu je – asa
- např. proteinasa, alkoholdehydrogenasa, laktátdehydrogenasa
Nazvosloví enzymů
- podrobnější klasifikaci IUBMB (INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND
MOLECULAR BIOLOGY)
• oxidoreduktasy (katalysují intermolekulární oxidačně-redukční reakce, např. ethanol +
NAD+ → acetaldehyd + NADH + H+)
• transferasy (přenos chemických skupin z molekuly donoru na akceptor, např. ATP +
glukosa → glukosa-6-fosfát + ADP)
• hydrolasy (štěpení vazeb vodou, např. sacharosa + H2O → glukosa + fruktosa);
• lyasy (nejčastěji adice na dvojnou vazbu nebo eliminace za vzniku dvojné vazby, např.
hydratace fumarátu v citrátovém cyklu -OOC-CH=CH-COO- + H2O → -OOC-CH(OH)-CH2-
COO-)
• isomerasy (isomerace, např. D-glukosa → D-fruktosa nebo L-alanin → D-alanin);
• ligasy (spojení dvou molekul, k němuž se dodává energii štěpením ATP nebo GTP, např.
karboxylace pyruvátu na oxalacetát CH3-CO-COO- + CO2 + ATP + H2O → -OOC-CH2-COCOO-
+ ADP + Pi)
např. EC 1.1.1.1 znamená
(EC) - Enzyme commision
(1, hlavní třída) - oxidoreduktázy (v reakci dochází k výměně elektronů)
(1, podtřída) - reakce probíhá na C-OH skupině
(1, podskupina) - kofaktor - zde NAD nebo NADP
(1, pořadové číslo) - určuje již konkrétní enzym - alkoholdehydrogenazu
Klasifikace enzymů
- studuje efektivitu a nejvhodnější podmínky pro enzymatickou reakci
- rychlost enzymatické reakce definována rychlostí jakou se substrát váže na enzym a
rychlostí jakou dochází k tvorbě produktu
nízká koncentraci substrátu vůči enzymu
- reakce téměř přímo úměrná jeho koncentraci
vysoká koncentrace substrátu vůči enzymu
- aktivní místa enzymu jsou zaplněny a nedochází k vazbě s přebytečným substrátem
- celková rychlost reakce závislá na tom, jak rychle dokáže enzym zpracovat substrát na
produkt
Kinetika enzymů
Dříve se podle pravidel Mezinárodní biochemické unie (IUB) z r. 1961 užívalo pojmu
enzymová jednotka (U) pro takové množství enzymu, které katalyzuje přeměnu 1 μmol
substrátu za minutu za standardních podmínek
Namísto toho byly zavedeny pojmy:
enzymová aktivita - rychlost přeměny substrátu
specifická aktivita - enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek ke hmotnosti
molová aktivita - enzymová aktivita vztažená za specifických podmínek k množství enzymu
vyjádřeno v molech
Převod dosavadních enzymových jednotek (U) na kataly (kat) se řídí vztahem:
1 U = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat
U nás byly zavedeny kataly do klinicko-biochemické laboratorní praxe povinně a výsledky
laboratorních vyšetřeni jsou takto vyjadřovány v séru nejčastěji jako μkat/l.
Kinetika enzymů - jednotky
Enzymová kinetika
- studium enzymatických reakcí: efektivita a nejvhodnější podmínky
- základní enzymatická reakce se dá vyjádřit touto rovnicí:
k1, k2 – rychlostní konstanty, popisujú rychlost dané reakce
k-1 – rychlostní konstanta rozpadu komplexu ES
Rychlostní konstanta je rovna rychlosti reakce při jednotkových koncentracích látek
Za předpokladu, že žádny produkt neinteraguje zpětně s enzymem za vzniku ES, lze
rychlost enzymatické reakce V (mol*s-1) definovat jako:
V = k2 [ES]
Problém je, že ES je neměřitelný.
Rychlost reakce se proto definuje podle koncentraci látek o kterých víme jejich
koncentraci.
Rozdělíme si vznik ES do dvou rovnic:
a) vzniku produktu: [ES] = k1 [E] [S]
b) rozpadu komplexu ES směrem k S nebo P: [ES] = (k-1 + k2) [ES]
Za předpokladu, že je v reakci enzym plně nasycen – tzn. koncentrace ES je stále
stejná:
K1.[E].[S] = (k-1 + k2).[ES] a dále
Enzymová kinetika
Koncentrace substrátu mezi nesaturovaným a saturovaným stavem enzymu je
definována pomocí Michaelisovy konstanty KM - konstanta poloviční saturace
- rovná se koncentraci substrátu, při které došlo k polovičnímu nasycení enzymu
substrátem
- reakční rychlost a je rovna polovině maximální rychlosti
Z rovnice enzymatické katalýzy lze KM vyjádřit jako:
Po dosazení do předchozí rovnice dostáváme:
Kinetika enzymů – Michaelisova konstanta
Za předpokladu, že koncentrace E v reakci je mnohonásobně menší než S ([E] << [S]), je [ES]
+ [S] ≈ [S].
Koncentrace volného enzymu lze definovat jako rozdíl celkového enzymu a ES:
[E] = [Eo] – [ES]
Po dosazení do rovnice dostáváme:
Po vyjádření [ES] dostáváme:
Víme už, že rychlost je definovaná jako: V = k2 [ES]
Po dosazení dostaneme:
Kinetika enzymů – odvození rovnic
- experimentálně sledovat momentální rychlost enzymatické reakce je ťežké
- proto se sleduje rychlost maximální Vmax
- Vmax je definována rychlostí enzymatické reakce při plné saturaci enzymu (po ní je
rychlost stabilní, lze ji pozorovat). Této rychlosti dosáhneme při [S] >>KM. Pak
[S]/([S]+KM) ≈ 1
Vmax následně definujeme z předchozí rovnice:
Následně dostáváme finální rovnici, ve které lze rychlost enzymatické rovnic získat
měřením pozorovatelných veličin: rovnice Michaelis-Mentenové:
Kinetika enzymů – odvození rovnic
- platí pro kinetiku enzymatické reakce s jedním substrátem (do katalytického místa
vstupuje pouze jedna molekula, která interaguje s enzymem)
v0 je počáteční rychlost enzymatické reakce
Vmax je limitní hodnota rychlosti při plném nasycení enzymu substrátem
[S] koncentrace substrátu
KM je Michaelisova konstanta
Pokud má enzym nízké KM, znamená to, že může dosahovat maximální rychlosti při nízké
koncentraci substrátu
Enzymy s KM při 10-8 – 10-10 M-1.s-1 – prakticky každý kontakt se substrátem vede k
přeměně na produkt.
Rovnice Michaelis-Mentenové
Nezohledňuje další faktory, které v reakci mohou nastat:
- inhibice reakce produktem
- zvratná reakce v meziproduktem
- nepopisuje allosterické chování proteinů (tedy že konformační změna proteinu
může ovlivnit enzymatickou aktivitu)
- kooperativní interakce
Navíc je platná za předpokladu, kdy:
- koncentrace ES se mění mnohem pomaleji než koncentrace P a S
- koncentrace enzymu se v čase nemění.
Rovnice Michaelis-Mentenové
Kinetika v takových reakcí navíc sleduje v jakém pořadí dochází k vazbě S na E
Bi-Bi reakce
- oba substráty se vážou na enzym v jednom okamžiku a
vyváří ternární EAB komplex
- může probíhat náhodným mechanismem - nezáleží na
pořadí ve kterém se substráty navážou
Bi-Bi mechanismus využívá například DNA Polymeráza
Multisubstrátové enzymatické reakce
Ping-Pong mechanismus enzymové reakce:
Enzym má dva stavy:
základní a intermediární (chemicky modifikován prvním substrátem)
A - substrát umožňující přenos chemické skupina na enzym a po jejím vypuštění dochází
k vazbě B, na který je chemické skupina z enzymu přenesena
Př. mohou být enzymy využívající kofaktory
Multisubstrátové enzymatické reakce
- allosterický – charakterizovaný odlišným prostorovým sterickým uspořádáním
- dochází ke kooperativní vazbě substrátu
- kinetika rozdílná oproti Michaelis-Mentenové
- struktura allosterických enzymů může být pozměněna vazbou allosterických efektorů do
allosterického místa (allosterické místo se nachází mimo aktivního místa)
- efektory mohou změnit konformaci vazebného nebo aktivního místa enzymu vedoucí jak
k aktivaci tak inhibici enzymatických procesů
Kinetika allosterických enzymů
Inhibitory - molekuly, které redukují
nebo blokují enzymatickou aktivitu
Aktivátory - enzymatickou aktivitu
zvyšují
Irreverzibilní inhibitory
- vytváří kovalentní (pevnou) vazbu na
inhibitor
- dochází k chemické modifikaci zbytků
AMK potřebné pro enzymatickou
aktivitu
Reverzibilní inhibitory
- vazba je nekovalentní (vodíkový
můstek, hydrofobní interakce, iontová
vazba)
V kinetice inhibiční reakce sledujeme primárně specificitu inhibitoru a také jeho účinnost.
Inhibitory enzymů
1) kompetitivní inhibitory
· strukturou podobné substrátu
· enzym nekatalyzuje přeměnu inhibitoru, inhibitor se
pouze na enzym naváže
· váží se do vazebného místa substrátu
· zvýšením koncentrace substrátu lze inhibici potlačit
· Km se v přítomnosti inhibitoru zdánlivě zvyšuje
· V max se nemění
2) nekompetitivní inhibitory
· nebrání vazbě substrátu na enzym
· váží se mimo vazebné místo substrátu
· inhibici nelze potlačit zvýšením koncentrace substrátu,
lze ji snížit pouze odstraněním inhibitoru
dialýzou (inhibitor se neváže kovalentně)
· žádný z komplexů enzym-inhibitor (E-I ani E-I-S) není
katalyticky aktivní ® snížení koncentrace
aktivního enzymu _ pokles Vmax
· Km se nemění
3) akompetitivní inhibitory
· váží se pouze na komplex enzym-substrát
· dochází ke zdánlivé změně Km i Vmax
Inhibice enzymů
Kompetitivní reverzibilní inhibice
- S a I se mohou vázat na enzym ve
stejném čase
- inhibitor je často strukturálně velmi
podobný substrátu, ale nedochází u
něj k enzymatické reakci
- I se tedy váže na vazebné (i
aktivní) místo enzymu. O tyto místo
S a I soupeří (kompetice)
Reverzibilní enzymové inhibice
- pokud zvýšíme koncentraci S, bude docházet k častějším interakcím mezi E a S inhibiční
účinek bude potlačen
- dochází k zvýšení KM (inhibitor obsazuje část molekul enzymu, pro vytvoření komplexu
enzym-substrát je tedy k dispozici jen málo molekul volného enzymu – reakce je
pomalá)
- Vmax se nemění
Akompetivní reverzibilní inhibice
- inhibitor se může vázat na jiné místo
enzymu (a to pouze v případě, kdy je
substrát vázaný na enzym)
- po vazbě dochází k změně struktury
enzymu vedoucí ke znemožnění
enzymatické reakce
- inhibitor se váže pouze na ES
- pro inhibici tedy potřebuje přítomnost
substrátu
- s rostoucí koncentrací substrátu vede k
zvýšené inhibice enzymu
- dochází ke snížení Vmax, tím se snižuje se
také i KM.
Reverzibilní enzymové inhibice
Smíšená reverzibilní inhibice
- inhibitor se váže na aktivní místo
enzymu nezávisle na tom, zdali je
aktivní místo prázdné nebo je S v
komplexu s enzymem
- má větší afinitu k jednomu nebo
druhému stav - mix kompetitivní a
akompetitivní inhibice
- vazba inhibitoru ovlivňuje vazbu S
(zvyšuje se KM) a zároveň snižuje
počet aktivních molekul enzymu
(snížení Vmax)
- inhibiční efekt může být redukován,
ale ne potlačen zvýšenou
koncentrací S
Reverzibilní enzymové inhibice
- specifický případ smíšené
enzymové inhibice
- inhibitor redukuje afinitu enzymu k
substrátu, ale neovlivňuje jeho
vazbu (S se tedy na enzym
neváže)
- podobně jako u akompetitivní
inhibice váže na jiné místo
proteinu a vyvolává strukturální
změny v aktivním místě enzymu.
Reverzibilní enzymové inhibice
Nekompetitivní reverzibilní inhibice
- inhibice je přímo závislá na koncentraci I, ne na koncentraci S
- když dojde k inhibici 50% enzymu, tak jak při nízké i vysoké koncentraci substrátu
- Vmax klesá - aktivita enzymu už je redukovaná a vysoká koncentrace S na ni nemá efekt
- KM zůstává stejná (mechanismus enzymatické reakce je stejný, ale s omezeným
množstvím aktivních enzymů)
- enzymy mohou být stabilní mezi
teplotou 0 až 100°C
- termofilní bakterie mají např. velmi
stabilní enzymy, které jsou aktivní i
při 110°C
- v lidském těle jsou enzymy
konstruovány na teplotu okolo 37°C
- aktivní pouze v malém teplotním
intervalu
- teplota, při kterém je enzym nejvíce
aktivní - teplotní optimum
Vliv teploty na enzymatickou reakci
- závislost reakce na teplotě je v oblasti
teplotního optima definováno Arheniovou
rovnicí
- s rostoucí teplotou získávají molekuly (S i E)
větší kinetickou energii a narůstá
pravděpodobnost ideální srážky mezi S a E
- při nízkých teplotách je sice enzym stabilní a
není ovlivněna struktura proteinu, ale počet
srážek je omezený
- při vyšších teplotách pak dochází k částečné
nebo úplné denaturaci (rozpadu 3D struktury
a tvorbě neuspořádaných proteinových
klubek) a degradaci proteinu
Vliv teploty na enzymatickou reakci
Vliv pH na enzymatickou reakci
- pH optimum závisí na funkci a prostředí, ve
kterém se protein vyskytuje
- záleží na AMK zbytcích v aktivním místě
- katalytická aktivita enzymů se odvíjí od
toho zda jsou AMK ionizované
- vysoké a nízké pH denaturuje proteinovou
strukturu
pH 7 – trypsin, enzymy v krvi
pH2 – pepsin
pH10 -arginasa