Metabolismus sacharidů 6/12 Metabolismus Látková výměna Metabolismus je souhrnem všech chemických reakcí v buňce. Tyto reakce umožňuji růst a rozmnožování organismu. Metabolické reakce lze rozdělit na: • katabolické - odbourávání a rozklad složitějších molekul na jednodušší, uvolnění energie, která byla uchována v chemických vazbách • anabolické - výstavba a tvorba složitějších molekul, spotřeba energie pro utvoření nových chemických vazeb Biochemické procesy, které látkovou výměnu doprovází, jsou popsány pomocí metabolických drah. Jedná se o sled chemických reakcí často katalyzovaných enzymy. Glykogen syntéza x glykogenolýza Citrátový cyklus Glukoneogeneze x glykolýza Ornithinový cyklus Syntéza MK x β-oxidace MK Makroergické sloučeniny Chemická vazba drží atomy ve vzájemné blízkosti. K tomu, aby taková vazba byla roztržena, je třeba vyšší energie než vazebnou energii. Proto je velmi obtížné získat energii pouhým rozbitím vazby. Některé molekuly dokáží při svém rozkladu uvolnit obrovské množství energie (trhaviny), ale ta je stále nižší než energie nutná k jejich syntéze. Přesto se některé vazby rozpadají snadněji než jiné. Příkladem může být nejdůležitější makroergická sloučenina – adenosintrifosfát (ATP). • Molekuly obsahující ve své struktuře makroergickou vazbu (značena „~“), které po svém štěpení uvolňují značné množství energie (nicméně tato energie nesouvisí s energií samotné vazby!). • Sloučeniny, které obsahují makroergní vazby. Makroergní vazba je taková vazba, při jejímž hydrolytickém štěpení se uvolní velké množství energie. • Příklady: ATP (adenosintrifosfát) a ADP (adenosindifosfát), GTP, CTP, UTP, acetyl-CoA, PEP (fosfoenolpyruvát),… • Všechny tyto sloučeniny obsahují 2 nebo 3 za sebou vázané zbytky kyseliny fosforečné H3PO4 a jejich hydrolytickým štěpením se uvolňuje energie. Makroergická vazba Makroergická sloučenina ATP Na ribóze je vázán adenin přes C1 uhlík (N-glykosidická vazba) a tři fosfátové skupiny přes C5 uhlík (fosfodiesterová vazba). Fosfátové skupiny jsou připojeny mezi sebou anhydridovými vazbami. Fosfáty v ATP (ADP, AMP) mají charakter rezonančních hybridů (dvojná vazba rezonuje mezi kyslíky). C1C5 N-glykosidická vazba Fosfodiesterová vazba Anhydridové vazby ATP slouží jako palivo v buňce. Podobně jako benzín je termodynamicky nestabilní (tzn. reakce jeho rozkladu probíhá velmi rychle a rovnováha chemické reakce je výrazně posunuta směrem k produktům). Také je kineticky stabilní (může koexistovat s dalšími substráty bez vzájemné reakce). Pro reakci vyžaduje impulz a tím je prostředí enzymu. ATP je hydrolyzován v prostředí vody za uvolnění fosfátu (hydrolýza ATP) a uvolnění energie (ΔG= -7,5 Kcal/mol), která je využita k vazbě uvolněného fosfátu na substrát. ADP (adenosindifosfát) vzniká hydrolýzou fosfátu z ATP. AMP (adenosinmonofosfát) vzniká hydrolýzou pyrofosfátu (PPi) z ATP. Během této reakce dochází k uvolnění větší energie než hydrolýzou ATP na ADP. ATP AMP ADP 2x H3PO4 - 1x H3PO4 - 3x H3PO4 - Fosfátové skupiny nesou záporný náboj a vzájemně se od sebe odpuzují. Energie makroergické vazby ATP nepopisuje energii uvolněnou rozpadem chemické vazby, ale rozdíl energií hydrolýzy fosfátové skupiny a vzniku nové vazby na substrátu. ATP v čisté vodě není stabilní proto, že síla anhydridové vazby posledního fosfátu je slabší než u vodíkového můstku. Enzymy využívající ATP a cytosol buňky obsahují atomy Mg2+ nebo Ca2+, které stabilizují negativní náboje fosfátových skupin a ATP aktivují. Vodíkový můstek Anhydridová vazba Směr chemické reakce také ovlivňuje koncentrace jednotlivých složek. V buňce je mnohonásobně vyšší koncentrace ATP, než by bylo potřeba pro vznik rovnovážného stavu. Buňka udržuje vysokou hladinu ATP a tím posouvá chemickou reakci k její hydrolýze. Reakce, ve kterých dochází k hydrolýze ATP, se tak stávají nereverzibilní – není dostatek energie ke zpětné syntéze ATP. Nicméně hydrolýza jiných fosforylovaných molekul má mnohem vyšší energii a dokáže předat fosfát zpět na ATP (a tím regenerovat zásobu energie buňky). Fosforylace na substrátové úrovni (substrate-level phosphorylation) Jedná se o : • přenos fosfátového zbytku z makroergického fosfátu (fosfoenolpyruvát, 1,3-bisfosfoglycerát, kreatinfosfát) na ADP pomocí enzymů z třídy transferas • „obrácená” reakce katalyzovaná ligasou (např. sukcinyl-CoA + GDP + Pi → sukcinát + CoA + GTP, reakce citrátového cyklu) Obnova ATP Oxidační fosforylace a fotofosforylace (oxidative phosphorylation) • je sled chemických reakcí, které ukončují energetické odbourávání monosacharidů, aminokyselin, mastných kyselin a glycerolu. • v dýchacím řetězci je významná účast koenzymů, které se během celého procesu oxidují (přeměna na jejich oxidované formy) Adenylát kinázová reakce • AMP vznikající odštěpením difosfátu z ATP je převáděn na ADP reakcí, která je katalyzována enzymem andenylát-kinázou • ADP je následně přeměněna na substrátové úrovni oxidační fosforylací nebo fotofosforylací. Energie potřebná pro syntézu ATP je dodávána metabolickým rozkladem složitějších molekul, které získáváme z potravy. V rámci enzymatických reakcí dochází jak k přímé syntéze ATP, tak i nepřímé syntéze ATP v respiračním (dýchacím) řetězci za pomoci redoxního potenciálu kofaktorů NAD+, NADPH a FAD. Jednou z takových metabolických drah je Pentózový cyklus. Pentózový cyklus Pentózový cyklus v těle generuje NADPH (v respiračním řetězci napomáhá syntéze ATP, navíc je důležitý v ochraně před oxidativním stresem). • transformuje 6C sacharidy (Glukózu – Glc, Fruktózu – Fru a Glaktózu – Gal) na 5C a 4C sacharidy. • 5C Ribóza je velmi důležitý stavební prvek molekul jako je ATP, NAD+ nebo nukleotidy v DNA a RNA. • 4C Erytróza je potřebná pro syntézu aromatických AMK a nebo ligninu u rostlin. Pentózový cyklus u živočichů probíhá v cytosolu, u rostlin v cytosolu a plastidech buněk. 1. fáze PC (oxidativní otevírání cyklických sacharidů) 2. fáze PC (ne-oxidativní přeměny sacharidů) Pentózový cyklus lze rozdělit na dvě fáze – oxidativní a neoxidativní. Oxidativní fáze Dochází k: • redukci NAD+ na NADPH • konverzi glukózy-6-fosfátu (Glc-6P) na ribulóza-5P (5C sacharid). Na začátku je Glc-6P redukována pomocí Glc-6P dehydrogenázy na 6-fosfoglukono-γ-lakton. Z reakce se uvolní H- (sloužící k redukci NADPH) a volný H+ (proton). Enzym 6-fosfoglukono-γ-laktonáza katalyzuje následnou hydrolýzu molekuly a rozštěpení cyklické molekuly. Dojde ke vzniku 6-fosfoglukonátu (disociované formy glukonové kyseliny). V reakci dochází k uvolnění dalšího protonu. Následně 6-fosfoglukonát dehydrogenáza vygeneruje další molekulu NADPH. Redukcí molekuly cukru dojde k destabilizaci molekuly a zániku vazby mezi karboxylovou skupinou a sousedním uhlíkem – uvolní se CO2. Sacharid tak přichází o jeden uhlík a vzniká 5C ribulóza-5P. Neoxidativní fáze Dochází k: • transformaci (izomeraci a translokaci uhlíků) mezi jednotlivými sacharidy Ribulóza-5P může být fosfopentóza izomerázou transformována na ribózu-5P (dojde k přesunu karbonylové skupiny v molekule) nebo fosfopentóza epimerázou na xylulóza-5P (změnou konformace OH- skupiny). Ribóza-5P a xylulóza-5P jsou substráty následné enzymatické reakce, ve které dojde k přenosu dvojuhlíkatého zbytku z jedné molekuly na druhou (pomocí enzymu transketolázy). Vzniká 7C sedoheptulóza-7P a 3C glyceraldehyd-3P. Transaldoláza naopak přenáší pouze 3C zbytky. Z 7C a 3C cukru nasyntetizuje 4C erytroza-4P a 6C Fru-6P. Ty mohou vstoupit do jiných metabolických drah. Xylulóza-5P a erytroza-4P nejsou příliš organizmem využívány, proto je Transketoláza může transformovat na 3C glyceraldehyd-3P a 6C Fru-6P. Pentózový cyklus je regulován enzymem Glc-6P dehydrogenázou. Enzym je kompetitivně a allostericky inhibován svým produktem NADPH, naopak aktivován NADP+. NAPDH je v buňce v nadbytku, proto je pentózová dráha aktivována společně s anabolickými dráhami, které NADPH oxidují na NADP+. Deficience Glc-6P dehydrogenázy vede k onemocnění známému favismus. Je to nejčastější enzymatický defekt u lidí (vyskytující se převážně u středomořské a africké populace). Defekt enzymu vede ke zvýšenému rozpadu červených krvinek. To je způsobeno tím, že NAPDH slouží k redukci antioxidantu glutathionu. Ten vychytává volné radikály a pomocí NADPH se regeneruje. Pentózový cyklus je jediný způsob jak si může erytrocyt NADPH vyrobit – jeho nedostatek vede k nárůstu oxidativního stresu a narušení buněčné struktury. Favismus napomáhá proti malárii. Parazit vyvíjející se v erytrocytu díky nepříznivému prostředí není schopen přežití. Zajímavost Glykolýza Metabolická cesta, ve které dochází ke konverzi glukózy na pyruvát, uvolňují se protony a syntetizují se makroergické molekuly – ATP a NADH. Glykolýza je anaerobní proces (neúčastní se jí volný molekulární kyslík). Celková bilance glykolýzy je: Výsledný pyruvát je následně využíván v respiračním cyklu (aerobní) nebo v mléčném a alkoholovém kvašení (anaerobní). Probíhá v cytosolu buněk. Glykolytických drah je několik, nejvyužívanější je Embden-Meyerhof-Parnasova dráha. Do glykolýzy jsou zahrnuty všechny 6C cukry, které tělo vstřebává. Galaktóza je fosforylována na Gala-1P enzymem galaktokináza. Gala-1P je pak přenesena na Uridildifosfát (UDP) pomocí Gala-1P urydiltransferázy. Gala-UDP je následně transformována na UDP-Glu- 1P enzymem epimerázou. UDP je nakonec recyklován vazbou další Gala-1P. Fosforylace je podobně jako u syntézy glykogenu přenesena na C6 uhlík Glu- 6P. Reakce je katalyzována Fosfoglukomutázou. Glu-6P je vstupním substrátem do glykolýzy. U fruktózy je to složitější. Fruktóza je transportována pouze do buněk jater, kosterního svalstva, ledvin, mozku a adipocitů. Ve svalech je fosforylována přímo na Fru-6P hexokinázou. Ta vstupuje přímo do glykolýzy. Ale v játrech enzym fruktokináza fosforyluje Fru na Fru-1P. Enzym aldoláza následně rozštěpí Fru-1P na glyceraldehyd a dihydroxyaceton-3P. Glyceraldehyd je pak fosforylován glyceraldehyd kinázou na glyceraldehyd-3P. Dihydroxyaceton-3P je triózafosfát izomerázou převeden také na glyceraldehyd-3P. Glyceraldehyd-3P pak vstupuje do glykolýzy. Samotná Glykolýza začíná u molekuly glukózy. V prvním kroku je Glu fosforylována na Glu-6P hexokinázou. V reakci je využita hydrolýza ATP. Fosforylace je důležitá, protože snižuje koncentraci Glu v buňce a neblokuje tak funkci glukózových transportérů (které mohou dále nasávat glukózu dovnitř buňky). Navíc fosforylace zabraňuje úniku Glc-6P ven z buňky difúzí, protože získává náboj a hůře proniká hydrofobní vrstvou cytoplazmatické membrány. První reakce může být katalyzována dvěma enzymy – hexokinázou a glukokinázou (hepatocyty, βbunky pankreatu). Glukokináza je specifická pro glukózu, ale má pro ní nižší afinitu než hexokináza. To ji znemožňuje fosforylovat glukózu při její nízké koncentraci. Dalším rozdílem je, že hexokináza je kompetitivně inhibována svým produktem – Glc-6P. Glukokináza je naopak inhibována až produktem v dalším kroku glykolýzy, Fru-6P. Hexokináza Enzym je maximálně aktivní při dolní hranici normální glykémie (3,5 mmol/l). Glukokináza Receptor hladiny glukózy v krvi, protože do jaterních buněk se glukóza transportuje nezávisle na inzulínu. Při vysoké koncentraci glukózy je glukokináza aktivní a začne produkovat velké množství Glc- 6P – které je potřebné pro syntézu glykogenu. Fru-6P narůstá při nízké koncentraci glukózy, kdy je aktivita glukokinázy omezena. V druhém kroku je Glc-6P přeměněna na Fru-6P pomocí Glc-6P izomerázy. Reakce je reverzibilní – dopředu je hnána nízkou koncentrací produktu, který je zkonzumován dalšími kroky glykolýzy. Při vysoké koncentraci Fru-6P reakce běží opačně. Fru-6P je fosforylována na C1 uhlíku fosfofruktokinázou. Vzniká 1,6-bisfosfo-Fru. Je zde využita další molekula ATP a díky tomu je reakce nevratná. Přidáním druhého fosfátu dochází k destabilizaci molekuly, které se budou v dalším kroku štěpit. Je potřeba, aby obě byly nabité a neunikaly ven z buňky difúzí. C1 Destabilizace 1,6-bisfosfo-Fru umožňuje rozpad molekuly na 2 triózy (dihydroxyaceton-P a glyceraledhyd-3P) pomocí enzymu aldoláza. V dalším kroku je dihydroxyaceton-P transformován na druhý glyceraledhyd-3P pomocí triosafosfát isomerázy. Dvě molekuly glyceraldehyd-3P jsou deprotonovány glyceraldehyd-P dehydrogenázou s NAD+ kofaktorem. Navíc dochází k vazbě dalšího fosfátu (který tentokrát pochází z hydrogenfosforečnanového aniontu z roztoku, nikoliv z ATP). Fosfátová skupina se přenáší na ADP enzymem fosfoglycerátkinásou. Vzniká ATP a 3-fosfoglycerát. Tento krok je citlivý na hladinu ADP v buňce, pokud má buňka velký přebytek ATP, tak reakce neproběhne. (2 molekuly = 2ATP) Fosfoglycerát mutáza katalyzuje vznik 2-fosfoglycerátu (přenese fosfát z C3 na C2 uhlík). C3 C2 Enzym enoláza dehydratuje 2-fosfoglycerát a dochází ke vzniku dvojné vazby ve fosfoenolpyruvátu. Pyruvátkináza přenese zbývající fosfát na další molekulu ADP. Vzniká pyruvát, který je zpracován v dalších metabolických reakcích. (2 molekuly = 2ATP) Regulace glykolýzy. Hexokináza, glukokináza – rozhodují zda glukóza bude využita pro tvorbu energie nebo uskladněna v glykogenu. 2,6-bisfosfo-Fru – aktivátor fosfofruktokinázy katalyzovaný fosfofruktokinázou 2. Ta je regulovaná hormonálně inzulínem/glukagonem. Snížená hladina vede ke snížení aktivity fosfofruktokinázy. Naopak dochází ke zvýšené aktivitě enzymu katalyzující opačnou reakci (defosforylaci). Pokud je nedostatek glukózy v krvi, játra jsou schopna obrátit směr glykolýzy a začít glukózu syntetizovat. Tento proces se nazývá glukoneogeneze. Játra tak udržují stabilní hladinu glukózy v krvi. Kromě jater je glukoneogeneze přítomná i ve dřeni ledvin. Glukóza je syntetizována z necukerných molekul • pyruvátu, glycerolu (vznikající degradací lipidů), laktátu a některých AMK. Při glukoneogenezi jsou spotřebovávány ATP a GTP. Glukoneogeneze x glykolýza Glukoneogeneze Prvním krokem glukoneogeneze je karboxylace pyruvátu (vazba HCO3 -) na oxalacetát. Tato reakce probíhá v mitochondriích a je katalyzována pyruvát karboxylázou. Během reakce dochází k hydrolýze ATP. Pokud je v mitochondrii vysoká hladina ADP nebo glukózy, je enzym inhibován. (Na jednu glukózu jsou třeba 2 molekuly pyruvátu!) Oxalacetát se potřebuje dostat ven z mitochondrií do cytosolu, kde se nachází další enzymy. Proto je redukován na malát enzymem malát dehydrogenázou. Mitochondrie má na své membráně proteiny (malátový můstek), které transportují malát do cytosolu. V cytosolu je malát pomocí NAD+ oxidován zpět na oxalacetát (opět malát dehydrogenázou). Oxalacetát je pak dekarboxylován a fosforylován enzymem fosfoenolpyruvát karboxykinázou. Jako zdroj fosfátu enzym nevyužívá ATP, ale GTP. Následné kroky jsou podobné s glykolýzu (ta probíhá obráceným směrem). Fosfoenolpruvát je konvertován na glyceraldehyd-3-P a dihydroxyaceton-P. GlukoneogenezeGlykolýza Aldoláza spojí 3C sacharidy a vzniká 1,6 – Fru-bisfosfát. Enzymy hydrolyzující ATP v enzymatické reakci nejsou schopny zpětné reakce. Proto jiný enzym, 1,6 – Fru-bisfosfátáza katalyzuje odštěpení fosfátu z C1 uhlíku. Fosfatáza je regulována přes malou molekulu, cAMP (cyklický monofosfát), jehož produkce je zvýšena přes hormonální regulaci glukagonem/inzulínem. Fosfoglukoizomeráza pak transformuje fruktózu na Glc-6P. Ta je další fosfatázou (Glc-6P fosfatáza) defosforylována a glukóza může být uvolněna do krevního oběhu. Jednou z látek, ze kterých lze vytvořit glukózu je laktát. Ten vzniká z pyruvátu v buňkách, které mají nízkou hladinu kyslíku (např. svalové buňky při sprintu). Kyslík (v respiračním cyklu) je důležitý pro regeneraci kofaktoru dehydrogenáz, NAD+. Ten je v glykolýze redukován na NADH. Pokud by NAD+ nebylo regenerováno, dojde k zástavě glykolýzy. Mechanismu, který krátkodobě dokáže hladinu NAD+ navýšit je redukce pyruvátu na laktát pomocí enzymu laktát dehydrogenáza (v tzv. mléčném kvašení). Mléčné kvašení Mléčné kvašení se běžně vyskytuje a využívá u bakterií. Reakce je součástí vzniku mléčných produktů – jogurtů a zakysané smetany. Zde laktát snižuje pH natolik, že zamezuje růstu patogenních bakterií a také mění chuť mléka. Ve svalech vzniká při krátkodobé zátěži. Laktát se ve svalech neukládá, ale je transportován do krve a vychytáván játry. Zde se pomoci laktát dehydrogenázy oxidují zpátky na pyruvát. Výměna laktátu mezi svalovou a jaterní buňkou se nazývá Coriho cyklus. • bakterie a kvasinky • využíváno k přípravě alkoholických nápojů nebo pečiva Funkce podobná jako u mléčného kvašení – regenerace NAD+. V prvním kroku je pyruvát dekarboxylován na acetaldehyd pomocí acetaldehyd dehydrogenázy. Následně dochází k redukci acetaldehydu na ethanol (během níž dochází k přenosu H- z NADH na substrát) alkoholdehydrogenázou. Alkoholové kvašení Alkoholové kvašení nepotřebuje kyslík, některé kvasinky této dráze dávají přednost před respiračním cyklem i za jeho přítomnosti.