1
Sekvenace Nanopórem
1. Třetí generace sekvenátorů
2. Princip sekvenace
3. Pór
4. Laboratorní příprava
5. Squiggle
6. Srovnání s NGS
https://nanoporetech.com/resource-centre/introduction-nanopore-sequencing
2
Sekvenace nanopórem
3
Třetí generace sekvenátorů
̶ Dlouhé čtení
̶ Single-molecule sequencing
̶ Epigenetika (methylace, změny histonů, …)
̶ Snadnější assembly
̶ Rychlost
4
Třetí generace sekvenátorů
̶ Detekce změny elektrického napětí při průchodu molekuly DNA
nanopórem
5
Princip sekvenace
̶ Dostatečně malý
̶ Stabilní
̶ Editovatelný
̶ Biologický
̶ Pevný (solid-state)
6
Nanopór
̶ Alpha hemolysin
̶ CsgG-CsgF
̶ Průměr ~ 1nm
̶ Vazebná místa pro modifikaci
̶ DNA sonda
̶ Molekulární motor
̶ Ligandy pro specifické proteiny
7
Biologický nanopór
(A) MspA pore (PDB ID 1UUN) with a constriction site diameter of 1.2 nm, and a stem length of ~3.7
nm (B) Alpha Hemolysin (PDB ID 7AHL) with a constriction site diameter of 2.6 nm and a stem length of
5.2 nm (C) Aerolysin porin (PDB ID 5JZT) with a constriction site diameter of 1 nm, and a stem length
~10 nm. (D) A simplified depiction of OmpG pore (PDB ID 2F1C) with a constriction site of 1.3 nm. (E)
CsgG-CsgF mutant (PDB ID 6SI7) with two constriction sites: the original CsgG constriction of 1 nm
diameter (chain monomer of the original CsgG pore is depicted in red); and a secondary constriction
caused by the insertion of CsgF (Cyan residues) with a 1.5 nm diameter. The insert shows the
approximated diameter of the second constriction site, ~1.5 nm. Protein chains are depicted in different
colors to help with distinction.
̶ Grafenové struktury
̶ Vyšší napěťové zatížení
8
Pevný nanopór
̶ Dostupné kity dle aplikace
̶ Fragmentace
̶ Ligace barcodů
̶ Ligace sekvenační adaptérů
9
Laboratorní příprava
̶ Signálový výstup
̶ Čím je ovlivněn?
10
Squiggle
- Guppy
- Open-source software
11
Basecalling
̶ Výstup ve formátu *.fast5 (hdf)
̶ Obsahuje metadata
̶ Export do *.fastq
12
Zpracování dat
13
Porovnání s Illumina
Oxford Nanopore Illumina
Délka readů < 2 Mbp < 600 bp
Přesnost 87-98 % 99 %
Cena za Gbp $ 50-200 (minION)
$ 20-40 (PromethION)
$ 40-60 (NextSeq)
$ 10-35 (NovaSeq)
Real time Ano Ne
DNA modifikace (methylace) Ano Ne