Biologie + Histologie
Aleš Hampl
Brno, 2011
Přednáška 2
• Živá hmota, nebuněčné organismy, prokaryontní a eukaryontní buňky
• Mnohotvárnost (diverzita) buněk
• Proliferace buněk
• Diferenciace buněk
• Podstata diverzity buněk – exprese genetické informace (mRNA, proteiny)
• Programovaná buněčná smrt
• Strukturální organizace buňky
Proliferace
Diferenciace
Morfogeneze
Vývoj
Strukturální a funkční
specializace buněk
Trojrozměrná
organizace buněk s
různou funkcí do
funkčních skupin
Multiplikace buněk=
=
=
&
&
Programovaná
smrt
Smrt buněk v
očekávaném čase a
místě
=
&
Zygota
Mnohobuněčné
embryo
Dynamický
mnohobuněčný
organismus
Dělení buněk
&
Specializace buněk
Dělení buněk
&
Specializace buněk
DIFERENCIACEBUNĚK
MNOŽENÍBUNĚK
Mnohotvárnost buněk je produktem vývojových procesů
Hematopoéza
(jako příklad)
Kmenová buňka
Prekurzory
(myeloidní a lymfoidní)
Progenitory
Terminálně
diferencované buňky
DIFERENCIACE
Diferenciace je postupný
(vícestupňový) proces
Zvyšování diferencovanosti buněk
Zužování vývojové kapacity buněk - determinace
Jakmile buňky jednou vstoupí do určitého
vývojového směru (linie), již tento směr (linii) nemění.
(například buňky erytroidní linie „nepřeskočí“ do linie myeloidní)
Dediferenciace - ztráta diferencovaného fenotypu
• je obvyklá v podmínkách in vitro (představuje adaptaci
na kultivační podmínky)
• existence tohoto jevu in vivo je otazná a je předmětem
výzkumu (stejně jako transdiferenciace)
Výjimkou jsou nádorové buňky
• nádorové buňky jedné linie se mohou vlivem chemoterapie
„změnit“ v nádorové buňky jiné linie
• u nádorových buněk je často obtížné říct z jaké buněčné
linie jsou odvozeny
Genetický program
= Geny
Proteiny
Buňky
Tkáně
Orgány
Genetická informace
je užívána postupně na
základě aktivity
malého počtu
funkčních modulů,
které jsou
hierarchicky
uspořádány s rostoucí
úrovní složitosti.
Každá úroveň obsahuje
informaci pro
zbudování následující
vyšší úrovně.
Na každé úrovní
vznikají funkční sítě z
daných elementů.
Jedna část těchto sítí
působí zpětně na
předchozí úroveň,
druhá část podmiňuje
formování elementů
vyšší úrovně.
g
a b j c
i
e f
A
C F G
B
D E
Obecný princip regulace
Faktory (signály) regulující diferenciaci
Solubilní regulátory
• Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,…)
• Růstové faktory (TGF-transformující růstový faktor,
FGF-fibroblastový růstový faktor, interleukiny, …)
• Vitaminy (D, …)
• Ionty (Ca++, …)
Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions)
Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin, …)
Polarita a tvar buněk
Fyzikální parametry prostředí (teplota, tenze O2, …)
Jsou zpracovány molekulárními regulačními mechanismy a sítěmi
Univerzální molekulární podstata regulačních mechanismů a sítí
• Existuje relativně malý počet různých molekulárních sítí
• Tyto molekulární sítě jsou evolučně značně konzervovány
• Stejné molekulární sítě jsou používány v různých částech organismu
pro řízení různých procesů (jedna molekulární síť interpretuje jeden
signál v závislosti na aktuální molekulární konstelaci buňky)
Fibroblastový růstový faktor - FGF
Hematopoetická KB Leukemická KB
Mutace
Normální růst
a diferenciace
Normální krevní buňky
Porucha
diferenciace
Leukemické blasty
Porucha diferenciace jako zdroj nemoci
Jeden příklad za všechny
Diferenciace buněk in vivo
(léčba nemocí = „differenciační
terapie“ – cancer, …)
Máme použití pro znalost molekulárních
mechanismů, které řídí diferenciaci ?
Diferenciace buněk in vitro
(manipulace s kmenovými buňkami = buněčná
terapie)
Ani současné techniky molekulární biologie však nečiní
z poznání vývojových procesů triviální úkol !!!
Lineární
informace
v genech
Proces vývoje, který
se odehrává ve
čtyřech rozměrech:
Prostor (x,y,z) + Čas
… protože
?
Jak buňka vypadá a co vše umí
určují bílkoviny - proteiny
• u většiny buněčných typů tvoří nejméně 50% jejich suché hmoty
• hrají klíčovou úlohu ve většině biologických procesů
Proteiny
„Proteios“ - první místo (řecky) = Bílkoviny
Klíčová úloha proteinů je dána mnohočetností jejich funkcí
Enzymatická
Proteiny - enzymy, které selektivně modulují chemické reakce
Strukturální
Strukturální (stavební, podpůrné) proteiny – kolagen, elastin, keratin …
Signální
Proteiny zprostředkující přenos informací – hormony, cytokiny, receptory…
Motorická
Proteiny zajišťující pohyb – myosin, aktin …
Ochranná
Proteiny chránící před nežádoucími substancemi – imunoglobuliny …
Transportní
Proteiny přenášející substance – hemoglobin, transferin, …
Zygota
Mnohobuněčné
embryo
Dynamický
mnohobuněčný
organismus
DIFERENCIACE
STABILNÍ GENOM
Genomická ekvivalence
(= stejné množství DNA a stejná
nukleotidová sekvence ve všech
buňkách organismu – klonování)
VARIABILNÍ
TRANSKRiPTOM
Regulátory transkripce
X
VARIABILNÍ PROTEOM
Mnohočetnost funkcí proteinů stojí na unikátních
vlastnostech jednotlivých proteinů
DNA
Sekvence nukleotidů
(4 různé nukleotidy)
PROTEINY
Sekvence aminokyselin
(20 různých aminokyselin)
X
Stejné vlastnosti
+
Jediná funkce
Uložení a přenos informace
Různé vlastnosti
+
Různé funkce
Stejný princip
X
Sekvence nukleotidů
neovlivňuje zásadně
vyšší uspořádání
řetězce DNA
Sekvence aminokyselin
má zásadní vliv na
vyšší uspořádání
molekuly proteinu
?
!
Vyšší uspořádání molekuly proteinu je určeno sekvencí
aminokyselin a jejich postranními řetězci (R)
C
H
R1
CN
H
H
O
C
H
R2
N
H
C
H
R3
CN
H
OH
O
C
O
Primární
struktura
Představuje lineární
sekvenci aminokyselin v
polypeptidovémm
řetězci.
Sekundární
struktura
Je podmíněna
interakcemi mezi
komponentami páteřního
řetězce polypeptidu
(alfa helix, beta
skládaný list).
Terciární
struktura
Je podmíněna
interakcemi mezi
postranními řetězci
(vodíkové vazby,
disulfidické můstky,
iontové vazby,
hydrofobní interakce).
Kvarterní
struktura
Je podmíněna spojením
více polypeptidových
podjednotek.
Vyšší uspořádání molekuly proteinu
Denaturace
• ztráta vyššího uspořádání molekuly proteinu daná změnou fyzikálních či chemických podmínek prostředí,
obvykle doprovázena ztrátou funkce proteinu, může být reverzibilní (např. poškození proteinů při horečce)
Vyšší uspořádání proteinu spolurozhoduje
o jeho funkci.
Funkce proteinu je téměř vždy závislá na jeho
schopnosti rozeznávat či vázat jiné molekuly.
&
K čemu je dobré vyšší
uspořádání molekuly proteinu ?
Molekula CDK10 s vazebným místem pro ATP
DNA určuje expresi/metabolismus
proteinů v zásadě dvojím způsobem
Syntéza mRNA
daného proteinu
Stabilita mRNA
daného proteinu
Primární sekvence aminokyselin
daného proteinu
(určuje vlastnosti - stabilitu
daného proteinu)
Na úrovni
transkriptů
Na úrovni
proteinů
+
TranslaceANO/NE
Syntéza polypeptidů podle sekvence mRNA
se odehrává procesem zvaným „translace“
Molekulární komponenty
klíčové pro translaci
Messenger RNA
(mRNA)
Ribosomy
Transferová RNA
(tRNA)
Ribosomy - obecně
Vytváří prostředí pro rozeznání kodónů mRNA
a následnou syntézu polypeptidového řetězce
Proteiny - 1/3
Ribosomální RNA
rRNA – 2/3
Obecné složení ribosomů
Díky obrovskému počtu ribosómů v buňce
je rRNA nejhojnějším typem RNA
(syntetizována v jadércích RNA PolI)
Eukaryota
Ribosomy necitlivé
k některým
antibiotikům
Prokaryota
Ribosomy citlivé k
některým
antibiotikům
Rozdíly mezi ribosomy eukaryot a prokaryot mají medicínský význam
X
Transferová RNA - tRNA
Zajišťuje:
• transport aminokyselin do místa syntézy polypeptidového řetězce
• interpretaci kodónů mRNA
Délka tRNA – jen asi 80 nukleotidů
Vazebné místo
pro aminokyselinu
Vodíkové
vazby
Antikodon
Aminoacyl-tRNA syntetáza
• katalyzuje vznik kovalentní vazby mezi
aminokyselinou a jí odpovídající tRNA
• požaduje ATP
• výsledným produktem je aminoacyl tRNA
(= „aktivovaná aminokyselina“)
3` 5`
5`
3`
Translace
ribosomy
mRNA
100 nm
POLYRIBOSOM
(klastr ribosomů překládající
určitý úsek mRNA)
mRNA 5` AUG 3`
START kodon
3`UAC 5`
Met-tRNA
Začátek translace
mRNA 5` UAG 3`
Konec translace
mRNA 5` UAA 3`
mRNA 5` UGA 3`
STOP kodony
váží „uvolňující faktor“E P A
5`
3`
směr čtení mRNA
=
směr pohybu ribosomů po mRNA
kodony
Aminoacyl tRNA
Volné tRNA
Rostoucí polypeptidový
řetězec
Regulace translace
Blokování mRNA regulačními proteiny
• vazbou na specifické struktury/sekvence
v nepřekládané 5` oblasti mRNA, obvykle brání
vazbě ribosomů
Nedostatečně dlouhý poly-A konec mRNA
• na 3` nepřekládaném konci mRNA
• mechanismus typický pro dormantní mRNA
akumulovanou ve vajíčku
Inaktivace faktoru/ů nutných pro iniciaci
translace
• globální inhibice translace
• mechanismus také typický pro vajíčko
Obvykle se odehrává na úrovni iniciace translace
Regulace funkce proteinů se odehrává
také po jejich syntéze
Posttranslační modifikace proteinu
• proteolytické štěpení pro-proteinu (inaktivní
forma) za vzniku aktivního proteinu (např. proinsulin
na insulin)
• přidání modifikujících chemických skupin
(fosforylace, glykosylace, acetylace, metylace a
reverze těchto změn)
Transport proteinu do místa jeho funkce
• transport z cytoplasmy do jádra
(např. transkripční faktory)
• transport z cytoplasmy na membránu
(např. receptory)
Regulace doby života proteinu
• doba života proteinů se pohybuje v širokém
rozmezí (minuty až dny)
Regulace doby života proteinů
Délka života proteinů spolurozhoduje o jejich účinkování v buňce
Degradace proteinů musí být proto realizována
mechanismem umožňujícím precizní řízení
Který to je
?
Hydrolytické štepení
proteinů v lysosomech
Degradace proteinů
„ubiquitin-proteasomovou“
cestou
Aaaron Ciechanover
*1947
Israel
Technion - Israel Institute
of Technology, Haifa
Avram Hershko
*1937
Israel
Technion - Israel Institute
of Technology, Haifa
Irwin Rose
*1926
USA
University of California
Irvine, CA, USA
Nobelova cena za chemii 2004
„za objev degradace proteinů mechanismem využívajícím ubiquitin“
Degradační cesta „ubiquitin-proteasom“
KLÍČOVÁ FAKTA
Je zodpovědná za
degradaci většiny
(minimálně 80%)
všech druhů proteinů
přítomných v buňce
• regulaci hladiny/funkce mnoha
proteinů
(cykliny, transkripční faktory, signální proteiny,…)
• eliminaci denaturovaných,
nesprávně syntetizovaných,
nesprávně posttranslačně
upravených, či jinak
poškozených proteinů
(až 30% nově syntetizovaných proteinů je u
eukaryot degradováno během několika minut po
jejich syntéze)
Je zodpovědná za:
Realizuje se v
cytoplasmě i v
jádře
Její klíčoví „hráči“ jsou:
Ubiquitin – evolučně konzervovaný protein, 76 aminokyselin
Proteasom – proteolytický komplex, jehož funkce je závislá
na ATP, a který sestává ze tří jednotek:
• jeden centrální 20S proteasom (štěpí proteiny)
• dva 19S komplexy (řídí substrátovou specifitu a hrají regulační úlohu)
Molekulární aparáty pro translaci a degradaci
proteinů jako zdroje či účastníci abnormalit
člověka
ANO či NE ???
A N O
Abnormální translace jako
důvod rakoviny?
Podpůrné nálezy:
Vnímavost k nádorům
má vazbu na geny, které
kontrolují proteosyntézu
(např. TCS1/2, PTEN) a biogenezu
ribosomů (např. DKC1, S19)
Experimenty na zvířatech
ukázaly, že deregulovaná
exprese regulátorů
translace má onkogenní
efekty (například myši s mutovaným genem
Dkc-1 mají tendenci ke vzniku nádorů)
Některá efektivní
protinádorová léčiva
jsou cílena na klíčové
regulátory proteosyntézy
(například Rapamycin ovlivňuje mTOR kinázu)
Možné mechanismy:
Globální porucha translace
+ deregulace velikosti buněk
+ nadměrné dělení
Deregulovaná translace
vybraných onkogenních proteinů
Chybná translace se vznikem
aberantních proteinů
Vznik nádoru
Abnormality v intracelulární degradaci proteinů jako
důvod neurodegenerativních onemocnění?
Neurodegenerativní onemocnění s pozdním nástupem,
která jsou typická akumulací agregátů toxických proteinů
Proteinopatie
Cytosolická akumulace
• Parkinsonova choroba
• Huntingtonova choroba s nástupem v dospělosti
Nukleární akumulace
• Spinocerebelární ataxie typu 1
Extracelulární akumulace
• Alzheimerova choroba (beta amyloid)
Příklady onemocnění:
Hladiny a aktivity 20/26S
proteasomů jsou sníženy
v citlivých oblastech
u pacientů se sporadickou
Parkinsonovou chorobou
Příklady dysfunkcí:
Autosomálně recesivní
mutace genu E3 ligázy (parkin),
způsobující ztrátu funkce,
vyvolává Parkinsonovu chorobu.
Programovaná
buněčná smrt
Přirozený proces umožňující odstranění nežádoucích buněk.
(buněk nepotřebných pro další vývoj, buněk nesoucích genetické abnormality, infikovaných buněk, …)
Programovaná
buněčná smrt
Termín, originálně popisující buňky,
které umírají na očekávaném místě
v očekávaném čase
Apoptóza
Vyjadřuje morfologické charakteristiky
umírajících buněk, které jsou odlišné
od znaků nekrózy
Většina programované
buněčné smrti se
odehrává apoptózou
Termíny se zaměnují
Histologické
a
biochemické
znaky
Stimulus indukující buněčnou smrt
(např. ischemie) je sám o sobě
přímou příčinou likvidace buňky
Stimulus indukující buněčnou smrt
aktivuje kaskádu dějů, která
finálně vede k destrukci buňky
• Kondenzace chromatinu
• Smrštění buňky
• Zachování buněčných organel
a membrán
• Rychlé pohlcení sousedními
buňkami zabraňující zánětu
• Fragmentace DNA–TYPICKÝ ZNAK
• Zduření jádra
• Zduření buňky
• Disrupce buněčných organel
a membrán
• Ruptura buňky a uvolnění
buněčných komponent
• Zánětlivá reakce
Patologický proces
Fyziologická
(součást vývoje)
Aberantní
(při nemoci)
NEKRÓZAAPOPTÓZA
Mechanismus
X
Ischemická penumbra
(gradient nekrózy, apoptózy a
přežití buněk)
Ischemické
ložisko
(nekróza buněk)
Mozková
tepna
(kolaterální
zásobení)
Mozková
tepna Embolus
Apoptóza a nekróza při nemoci
Fragmentace genomické DNA
Internukleosomální
fragmenty (180 bp)
Elektroforetická separace DNA v agarózovém gelu
Morfologické znaky apoptózy
• Kondenzace chromatinu
• Tvorba měchýřků na povrchu buněk
Obraz v transmisním elektronovém mikroskopu Obraz ve skenovacím elektronovém mikroskopu
1972
Poprvé definován koncept programované buněčné smrti.
(Kerr, Wilie, Currie – Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging
implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer)
2002
Nobel Prize in Physiology or Medicine
„Genetic regulation of organ development and
programmed cell death“
Robert Horvitz (1947)
USA
John Sulston (1942)
UK
Sydney Brenner (1927)
UK
Nemoci + Apoptóza
Rakovina
Autoimunitní onemocnění
Diabetes
Neurodegenerativní onemocnění
Infertilita
Hepatitis
Septické stavy
Virové infekce
+ mnoho dalších
Molekuly regulující apoptózu jsou atraktivními
cíli pro farmakologickou intervenci !!!
Abnormality v apotóze se uplatňují u mnoha onemocnění !
Pochopení komplexních systémů musí stát
na pochopení struktury a funkce jejich součástí
Tissues
Buňky
Buňky Buňky
Tekutiny
Extacelulární
matrix
Vše je produktem buněk !
Tekutiny
• Intersticiální tekutina
• Plazma (krev)
• Lymfa (v lymfatických cévách)
• Cerebrospinální mok
• Intracelulární tekutina (cytosol)
Histologické metody studia buněk a tkání 1
Učinit pozorovatelným
Stabilizovat struktury
Fixace
Učinit objekty menšími – prostupnými
pro světlo
Zalití + Příprava řezů
Zviditelnit struktury
„Barvení“
Zvětšit
Použití mikroskopů
Světelné (optické) mikroskopy
(interakce fotonů s hmotou)
Rozlišení 0.1 m
• Pouze s viditelným světlem
• S fluorescenčním světlem
• Konfokální laserový skenovací mikr.
Elektronové mikroskopy
(interakce elektronů s hmotou)
Rolišení až 0.1 nm (v praxi 1 nm)
• Transmisní
• Skenovací
Marcello Malpighi
1628 - 1694
Italský lékař
Zakladatel mikroskopické anatomie a první histolog
• Popsal chuťové pohárky
• Popsal krevní kapiláry
• Možná první, kdo viděl v
mikroskopu červené krvinky
MalpiMalpigihogiho vrstvavrstva kůže
Stratum basale a stratum spinosum kůže
MalpigMalpigihoiho ttěěllíískaska v ledvinách a slezině
Žádná buňka není zcela stejná jako
buňky ostatní, všechny buňky ale mají
společné strukturální a funkční znaky.
Ne všechny buňky obsahují všechny komponenty o kterých budeme mluvit !
Buňky mají 3 hlavní součásti:
1. Plazmatickou membránu
2. Cytoplazmu
3. Jádro (eukaryontní b.)
1
2
3
Organizace buňky je postavena na
KOMPARTMENTALIZACI
Specializované funkce se mohou plnit v různých sektorech buňky
Membrány tvoří hranice mezi jednotlivými kompartmenty
Unikátní proteinové
a lipidové komponenty
a unikátní funkce
Unikátní kontrola
pohybu molekul
Unikátní složení
obklopeného prostoru
Kompartmenty & Membrány
Mnoho malých kompartmentů je lepší
Více plochy pro:
• regulaci
• výměnu živin
• odstranění odpadních
látek
Vetší plocha membrány
na obklopený objem
Plocha povrchu je proporcionální se čtvercem poloměru (r2
).
Objem je proporcionální se třetí mocninou poloměru (r3
).
Zmnožení X Redukce
vybraných kompartmentů
Diferenciace buněk
Specializace buněk
pro různé funkce
Drsné ER v sekrečních buňkách
Mitochondrie v buňkách srdeční svaloviny
Struktura biologické membrány 1
~2.5 nm
~2.5 nm 7-10 nm
~2.5 nm
Elektron denzní
Elektron opakní
Elektron denzní
Membránová jednotka
společná všem membránám
Buněčné membrány viděné
elektronovým mikroskopem
(pseudokolorováno)
Fluidní mosaika – Dvojvrstva lipidů s mobilními globulárními proteiny
Polární fosfolipidové zbytky
Cholesterol
Nepolární fosfolipidové zbytky
Hydrofilní segment
Hydrofobní segment
Struktura biologické membrány 2
Membránové lipidy
Představují 90-99% molekul v membráně (v počtech).
• Fosfolipidy - 75%
• Cholesterol - 20%
• Glykolipidy - 5% - pouze cytoplazmatická membrána - GLYCOCALYX
Membránové proteiny
Představují 1-10% všech molekul, ale 50% hmotnosti díky jejich velikosti.
Přenos signálůTransport Identita buněk
Adheze buněk
Enzymatická aktivita
PeriferníIntegrální
+
Struktura biologické membrány 3
Jádro 1
membránou ohraničená organela
Jádro jaterní buňky
Nejčastěji:
• Sférické (5-10 m) (lobulární, prohnuté, diskovité,…)
• Uloženo centrálně
• Jedno v buňce (osteoklast více, erytrocyt žádné)
Jadernámembrána
Jádro
Perinukleární cisterna
Lamina
Membránová jednotka
20-50 nm
80-100 nm
Vnější j. membrána
Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka
Jádro 2
Jaderná membrána - pokračování
Laminy:
• Intermediární filamenta - proteiny (A, B, C)
• Tvoří síť na vnitřní straně VJM, pronikají i do nukleoplazmy
• Udržují pevnost a architekturu jádra
• Ukotvují chromatin
• Regulují replikaci DNA a tranksripci rRNA
• Účastní se regulace apoptózy
Laminopatie
• Lidské choroby (nejméně 13 známých)
• Mutace v genech pro laminy
(popsáno asi 200 mutací)
• Deregulace exprese genů
• Předčasné stárnutí
Hutchinson-Gilford progerie
Vzácná - 1-4 na 8 milionů porodů
Missense mutace v laminu typu A
Perinukleární cisterna
Lamina
Membránová jednotka
20-50 nm
80-100 nm
Vnější jaderná membrána
Vnitřní jaderná membránaMembránová jednotka
Jádro 4
Chromatin
Heterochromatin
Feulgen positivní – tmavé ve světelném mikr.
Tmavé/denzní granula v TEM
Transkripčně inaktivní
Euchromatin
Neviditelný ve světelném mikroskopu
Relaxované chromosomy
Transkripčně aktivní
Interfázové jádro
2 nm
Dvojšroubovice DNA
30 nm
Vlákno chromatinu – seskládané nukleosomy
Jádro 3
Komplex jaderného póru
Průměr ~ 100 – 125 nm
Tři kruhy (každý 8 podjednotek)
Vnitřní vláknitý košík
Distální kruh
Jaderný kruh
Cytoplazm. kruh
Transport jadernými póry
(Nukleocytoplazmatický přesun)
• Proteiny, RNA, podjednotky ribosomů
• Oboustranný
• Vyžaduje jaderné lokalizační/exportní signály
• Podporován importiny/exportiny
• Regulován Ran GTPázami
Jádro 5
Jadérko
jadérkojaderná
membrána
nucleoplazma cytoplazma
Není ohraničeno membránou
Hlavní funkce
Syntéza RNA
Skládání ribosomů
Pars fibrosa
Primární transkripty rRNA
Pars granulosa
Skládání ribosomů
Fibrilární centra
Netranskribovaná DNA
NOR – nukleolární organizátor (na DNA)
V lidských buňkách na 5-ti chomosomech
(chr. 13, 14, 15, 21, 22)
Děkuji za pozornost
Otázky a komentáře na:
ahampl@med.muni.cz