PROGRAMOVANÁ BUNEČNÁ SMRT Lékařská biologie 2005/2006 IS 1/2 Lékařská biologie 2005/2006 effector nil it cm hup |B-.-g. mIuľ-: Lékařská biologie 2005/2006 Způsoby buněčné smrti: • smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího faktoru • smrt jako indukovaná sebevražda • katastrofická buněčná smrt • fyziologická buněčná smrt • apoptóza, autofagie, nekróza, onkoza Lékařská biologie 2005/2006 NEPROGRAMOVANA BUNECNA SMRT: nekróza • katastrofická smrt buňky v důsledku vnějších vlivu • příčinou ireverzibilní poškození některé ze základních buněčných funkcí m iKhqndfiaJ (hpfK cnigmjl n piHpn wwfYpd mpnüvij UW^49*i **B„ í Lékařská biologie 2005/2006 PROGRAMOVANÁ BUNEČNÁ SMRT (Programmed Cell Death, PCD) • indukovaný, regulovaný a selektivní proces pro vyřazování určitých buněk Apoptóza (apoptosis, type I PCD) • kaspázy, kalpainy, katepsiny, granzymy Autofagie (autophagy, type II PCD) • autofagozomy/autolysozomy (lysozomální proteázy) Lékařská biologie 2005/2006 DEVELOPMENT AND PATTERNS OF CELL DEATH APOPTOSIS condensation fragmentation no inflammation swelling cytotoxic death signals hormonal death signal AUTOPHAGIC CELL DEATH autophagic vacuoles post mortem degenerative changes, inflammation no inflammation Bursch, W. 2001 (Cell Death and Differentiation 8, 569-581) Lékařská biologie 2005/2006 Průběh a n 'odxnknl dmAiF preserved ňiclf«"fAq>j« normálni buňka smršťování poptózy: rozpad (fragmentace) apoptotická tělíska (apo-bodies) Lékařská biologie 2005/2006 Proč buňky podléhají apoptoze? 1. Apoptoza je nezbytná pro řádný vývoj organismu: • resorpce ocásku během metamorfózy pulce v žábu • odstranění tkáně mezi prsty během embryogenéze • odstranění nadbytečných neuronů při vytváření synapsí v mozku • uvolňování endometria na počátku menstruace Lékařská biologie 2005/2006 Proč buňky podléhají apoptóze? 2. Apoptoza je nezbytná pro likvidaci buněk, které představují ohrožení integrity organismu • buňky infikované viry • efektorové buňky imunitního systému po odeznění imunitní odpovědi • buňky s poškozením DNA zvýšená produkce proteinu p53 (induktor apoptózy) • nádorově transformované buňky Lékařská biologie 2005/2006 Morphology Apoptosis and Coll Proliferation in Tissue Homeostasis Roche Proliferation Apoptosis Proliferation Apoptosis proliferation of cells neoplasia regeneration of c oils neoplasia Proliferation Apoptosis equilibrium Proliferation Apoptosis dystrophy Proliferation Apoptosis dystrophy Lékařská biologie 2005/2006 Jak se „rozhoduje" o apoptoze? Odstranění pozitivního signálu • růstové faktory - neurony • Interleukin 2 (IL-2) - lymfocyty Přijetí negativního signálu • zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce, ROS • poškození DNA (volné radikály, UVR, gama záření, chemoterapeutika) • molekuly (death ligands), které se napojují na specifické receptory (death receptors) Lékařská biologie 2005/2006 MORFOLOGICKÉ A BIOCHEMICKÉ PŘÍZNAKY APOPTÓZY .. Zmenšení (smrštění) buňky !. Porucha adherence t. Poruchy permeability mitochondriální membrány a uvolnění cytochromu c k Blebbing plazmatické membrány >. Změny v plazmatické membráně k Kolaps jádra (degradace chromatinu) \ Zvýšená aktivita transglutaminázy >. Aktivace kaspáz, proteolytické štěpení >. Rozpad buňky na apoptotická tělíska .0. Fagocytóza apoptotických tělísek Lékařská biologie 2005/2006 Poruchy adherence • ztráta fokálních adhezí L. \ i s £ň :M Lékařská biologie 2005/2006 Změny v plazmatické membráně • externalizace fosfatidylserinu („eat me" signal) Phosphotidylseríne "Flip" nwmb-c™ osymnitHy Apoptotls phfls-phmidyEnřrne rtdiiträHifton ■|íi!!íí!!!řř!llHSH»HHIt«!!!l!íf||. bcForfl oflflr Lékařská biologie 2005/2006 Blebbing plazmatické membrány • degradace kortikálního cytoskeletu (fodrin, aktin) Lékařská biologie 2005/2006 Kolaps jádra (degradace chromatinu) kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra, později i v celém obsahu jádra internukleosomální štěpení DNA - žebříček (ladder) fragmentace jádra DiálUhM LlBfftflft ClftB ■ 400 bp 200 bp DNA fragmentation by CAD during apoptosis CAD ICAD • O ICAD ___CADmRNA / / CAť activation of caspases t ap op to ti c stimuli DNA fragmentation! CAD - caspase-activated DNase Lékařská biologie 2005/2006 Kolaps jádra (degradace chromatinu) Lékařská biologie 2005/2006 Detekce internukleosomálního štěpení DNA: TUNEL: TdT- •íMtiRlřšii dUTP nick end labelling Jin jJto end labeling (TUNEL} [lemplale independent) ]r— . + Terminal transferase + x-JNIľ(■) -> DAPI Lékařská biologie 2005/2006 Aktivace kaspáz, proteolyticke štěpení kaspázy cysteinove proteázy, štěpící na karboxyskupine kyseliny asparagové caspases = cysteinyl-aspartic-acid-proteases 14 druhů kaspáz: iniciační (2, 8, 9 a 10) efektorové (3, 6 a 7) inflamatorní (1, 4, 5, 11-14) r4 21. Lékařská biologie 2005/2006 Aktivace kaspáz, proteolyticke štěpení prokaspaza kaspáza 32-53 kDa N- Asp^X ma Asp-X >C pno-domain (3-24 kDa) large subunit £17-21 kDa) í cleavage J small subufill (10-13 kDa) O- ■o 1 active sice large subu-W&malt subunil heterodinrierĚ ^^ aktivní kaspáza o, active telfamer I 22. Lékařská biologie 2005/2006 Rozpad buňky na apoptotická tělíska • aktinový kontraktilní aparát 23. Lékařská biologie 2005/2006 Fagocytoza apoptotických tělísek • pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami (makrofágy, dendritické buňky) • fagocytující buňky vylučují cytokiny, které zabraňují zánětu ve tkáni Final stage of apoptosis Apoptotic cell • White blood cel 24. Lékařská biologie 2005/2006 Mechanismy indukce apoptózy iDÍUZlíig Rsdiítion v-;;ral infecl ioľi Coli StraíS teg grawlh fäcLor depletion, tjrlůplasmit Ěiresi, free radicals, serum sla-rvalrDri etc) T-ceM 25. Lékařská biologie 2005/2006 Mechanismy apoptózy APOPTOZA VYVOLANÁ VNITŘNÍMI SIGNÁLY: • zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií protein Bcl-2, vázaný k Apaf-1 • při poškození buňky protein Bcl-2: • uvolní Apaf-1 I kanály se uvolni cytochrom C z mitochondriích —> apoptosom: Apaf-1 Cytochrom C prokaspáza 9 (dATP) —> aktivní kaspáza 9 (iniciační) - aktivuje prokaspazu 3 —> aktivní kaspáza 3 (efektorová) - štěpí proteiny 26. Lékařská biologie 2005/2006 First stage of apoptosome formation Apaf-l cytochrome C Recruitment of procaspase-9 Caspase Activation 27. Lékařská biologie 2005/2006 Death receptor pathway FasL Mitochondrial pathway | Fas r F L a _ L s J FADD Procaspase-8 Active caspase-3 Diablo/SMAC \ — / DXXD polypeptides, Active .caspase-6 Cleaved substrates 28. Lékařská biologie 2005/2006 Roche Molecular Biochemicals Roche Hallmarks of Apoptosis 13 Apoptosis Induction Rtctptor Activation CytOChrúhl* c i Apjrf-1 Complex Formation D&orasing Mitochondrial Potential Activation of C as pases Phosphatidyls ari n a Exposure Morphological Changes DNA Fragmentation 120 Time (min) n with Lékařská biologie 2005/2006 Mechanismy apoptózy APOPTOZA VYVOLANÁ VNĚJŠÍMI SIGNÁLY: • indukce cy to toxickými T-lymfocyty (granzym B): přímá aktivace kaspáz (3, 7, 8, 10) • aktivační molekuly (death ligands) se napojují na specifické receptory v plazmatické membráně: Tumor necrosis factor a (TNF-a) - TNF receptor Lymphotoxin (TNF-ß) - TNF receptor Fas-ligand (FasL) - Fas receptor (CD95) přenos signálu do cytoplasmy přes adaptorové molekuly ( TRAD D, FADD) aktivace prokaspázy 8 aktivovaná kaspáza 8 štěpením dalších prokaspaz spouští proteolytickou kaskádu >. Lékařská biologie 2005/2006 membrane Death Domain FADD Puveaspase 8 TNFa TNFR1 rcĽcptors TRADD TRAF-2 ApüploLic Pathway Signalling Pathway Lékařská biologie 2005/2006 Death receptor pathway Mitochondrial pathway FasL I Fas, ^T FasL Fas -LL FasU FADD FasU H TO Plama membrane Procaspase-8 Other stimuli Granzyme B ?Other proteases I Truncated bid O—>D- Active caspase-9 A M Ajp JD Cytochrome c f the Year A Gunetic K«v lo Cancer „Some molecules are good guys, some are bad guys, and some become bad because they fail in their functions. The molecule p53 is a good guy when it is functioning correctly." Editor-in-Chief: Daniel E. Koshland Jr. Lékařská biologie 2005/2006 p53 objeven 1979 - původně Protoonkogen (mutatní forma) od 90. let - funkce tumorového supresoru, udržování genomove stability („guardian of genome"), indukce apoptózy WENDS in Plhannracoi'ogicflľ Sciences Lékařská biologie 2005/2006 aktivace p53 • poruchou metabolismu způsobenou viry nebo poškozením DNA (záření, ROS aj.) • buněčnou hypoxií • nedostatkem ATP • aktivací ankogenů DNA damage (e.g. nitric oxide. irradiation) Hypoxia ATM.ATR. CHK2 Cell-cycle checkpoints P21WAF1 14-3-3S GADD45 DNA repair GADD45 p48 P53R2 APE1 Polß Apoptosis PUMA XPB NOXA XPD Bax WRN APAF-1 BLM ^Oncogene activation E2F /T p14ARF 1 HDM2 Senescence P21WAF1 Others ■ RENDS in PhannacofogicBi Sciences Lékařská biologie 2005/2006 2002 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství Sydney Brenner John E. Sulston H. Robert Horvitz výzkum genetické regulace vývoje orgánů a programované buněčné smrti 32. Lékařská biologie 2005/2006 Caenorhabditis elegans 1090 somatických buněk, z toho 131 podléhá apoptóze regulace apoptozy - 14 genů Ced: Ced-3 (kaspáza 1), Ced-4 (Apaf-1) Ced-9 (Bcl-2)- represe - indukce 33. Lékařská biologie 2005/2006 Mammals C elegans ľ] asm a membrane "* Apoptosis Ced-3 | | Eg]-1 Diamini et al.9 2004 (Pharmacology & Therapeutics 101, 1- 15) 34. Lékařská biologie 2005/2006 Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972) 26, 239. ApoDtosis Publications/Year