DNA, RNA SONDY
SONDA, VYUŽITI
= Molekula NK sloužící k vyhledání určité sekvence ve vzorku DNA, RNA
> Využíváme při tom schopnost jedno vlákno vy ch molekul nukleových kyselin tvořit hybridní molekuly {pouze pokud obsahuje komplementární sekvenci)
> Sonda je uměle připravena s přesně zvolenou sekvencí ( metodou PCR - namnožení úseku DNA) —» vyšetření konkrétní sekvence ve vzorku
—> přítomnost chorobné nebo zdravé alely genu
—» intenzita exprese určitého genu v určité polulaci buněk
PODMÍNKY HYBRIDIZACE
>  Pouze jednovláknové molekuly
>  Pokud jsou sonda nebo vyšetřovaná NK dvoj vláknové, musí být nejdříve denaturovaný
>  Vznik stabilních H-můstků mezi sondou-
NK
>  ! Vliv teploty a koncentrace iontů!
> Nízké hodnoty —> hybridizace i ne přesně komplementárních molekul —> H-můstky budou stabilnější
podmínky hybridizace
> Při vysokých hodnotách bude hybridizace probíhat pomaleji nebo vůbec —» málo stabilní H-můstky
> Teplota se odvozuje od teploty tání sondy (množství energie nutné k uvolnění H-můstků)
> Teplota je závislá na délce molekuly a sekvenci
> Přísné podmínky zajistí stabilitu jen přesně
> spárovaných hybridních molekul^lze vyvodit závěr o přítomnosti či nepřítomnosti komplementární sekvence ve vyšetřované NK
PROVEDENI
> Dvoj vláknová molekula —» denaturace (vysoká T, denaturační činidlo - močovina, formamid)
> Smísení sondy s vyšetřovanou NK
> Zajištění podmínek pro hybridizaci
> Odmytí nenavázané sondy pufrem, udrží se jen dokonale komplementární sondy
DETEKCE
Pro zjištění proběhlé hybridizace musíme mít označeny molekuly použité sondy:
1)   Radioaktivním P značené nukleotidy —» radioaktivita —» expozice a vyvolání filmu, vznik tmavých skvrn
- citlivost, jednoduchost
2)   Použití antigénu —» vazba značené protilátky (fluorescenční barvivo, enzym)
—>• chemická reakce
- bez radioaktivity
FISH
>Fluoresc. barvivem značené sondy —> pozorování fluoresc. mikroskopem
> Hybridizace se sekvencí v centromere chromosomu —> určení genetické aberace (monosomie, trisomie)
CE&CfflP*&$J&& soü^yy
ĺ 0%'iis -ste cit i CK'ž so^py
		
	*** m '	T
*	* • 1	
		
>Pro každý chromosom jiné barvivo —» pozorování všech chromosomu současně —» snadná identifikace, posouzení morfologie, lokalizace genů, organizace chromosomu
^laloVjäcíso^bj