Vektory pre klonovanie génov Ľubica Byrtusová Tomáš Buday Čo je klonovanie DNA? Ü Je to množenie určitého úseku DNA Ü V molekulárnej genetike sa na klonovanie DNA výhodne využívajú enzymatické systémy živých buniek, ktoré sú schopné konkrétnu DNA kopírovať a klonovať prakticky bezchybne a pri nízkych nákladoch Ü Prakticky to znamená prinútiť určité bunky, aby kopírovali úsek cudzej DNA, ktorý sme predtým pripravili inou molekulárne -- genetickou metódou a ktorý po namnožení získame späť Pojem "vektor" v biológii Ü kolektívne označenie pre replikovateľné molekuly DNA (vírusy, plazmidy alebo umelé chromozómy), ktoré slúžia na klonovanie nukleových kyselín v bunkách Ako pripraviť úsek DNA pre klonovanie? Ü Technológia rekombinantnej DNA ü Všeobecné označenie postupov, ktoré umožňujú vytvárať nové kombinácie molekúl DNA, ktoré sa v prirodzenom stave spoločne nevyskytujú Ü Využíva možnosti: ü štiepenia DNA ü triedenia fragmentov štiepenej DNA ü identifikácie a izolácie konkrétnych fragmentov ü spájania fragmentov pomocou ligácie Technológia rekombinantnej DNA Ako prinútiť bunky kopírovať cudziu DNA? Ü Zjednodušene povedané -- musíme ich oklamať: ü cudzia DNA musí vyzerať ako ich vlastná ü musí mať všetky predpoklady pre vstup do danej živej bunky ü musí sa replikovať Ü Najlepšie je, ak jej množenie prináša hostiteľskej bunke určitú výhodu v porovnaní s bunkami bez cudzej DNA Aké bunky použiť pre klonovanie DNA? Kvôli jednoduchosti a ekonomickej výhodnosti kultivácie sa používajú: Ü baktérie (krátke úseky) Ü kvasinky (dlhé úseky DNA vcelku) Aký klonovací vektor použiť? Ako sa klonuje pomocou plazmidu? Ü Plazmidy vhodné na klonovanie sú komerčne dostupné ü Najznámejší plazmid pBluescript Ü Zloženie plazmidu: ü sekvencia, ktorú rozoznáva DNA polymeráza hostiteľskej bunky--tzv. ori sekvencia (ColE1ori) ü gén zabezpečujúci hostiteľským bunkám, ktoré plazmid uchovávajú a množia, určitú selekčnú výhodu oproti bunkám, ktoré plazmid neobsahujú (rezistencia voči ampicilínu) ü mnohopočetné klonovacie miesto, kde sa dá plazmid rozštiepiť rozličnými reštrikčnými endonukleázami Ako sa klonuje pomocou plazmidu? Ako plazmid dostať do baktérie, naklonovať a získať späť? Ü Baktérie majú okrem cytoplazmatickej membrány aj bunkovú stenu -> treba prekonať dve bariéry Ü Postup, ktorým sa do baktérie vpravuje plazmid sa označuje ako transformácia ü na jej úspech treba použiť tzv. kompetentné bunky (tzn. bunky schopné prijať cudziu DNA) ü takisto je potrebná destabilizácia cytoplazmatickej membrány (tepelný šok, ióny Ca^2+) Ü Transformované baktérie je výhodné kultivovať v podmienkach, ktoré zvýhodňujú udržovanie a množenie plazmidu Ü Zmnožené plazmidy sa získajú adsorpciou na silikátový povrch ü podmienky sú upravené tak, že sa získajú selektívne malé molekuly -- plazmidy, zatiaľ čo bakteriálny chromozóm sa behom izolácie stratí Ako spoznáme, že baktéria obsahuje plazmid s vloženou molekulou cudzej DNA? Ü Pri vkladaní cudzej molekuly DNA do plazmidu technológiou rekombinantnej DNA sa cudzia DNA nemusí spojiť s linearizovaným plazmidom ü uzavretie plazmidu bez včlenenia cudzej DNA ü spájanie plazmidov alebo cudzích molekúl medzi sebou apod. Ü Táto zmes je po ligačnej reakcii použitá na transformáciu baktérii Ü Nie každá baktéria musí plazmid prijať, resp. prijme nežiadúci plazmid ü tieto baktérie je treba odlíšiť ü rozlišovanie má dve fázy Ako spoznáme, že baktéria obsahuje plazmid s vloženou molekulou cudzej DNA? Ü I. fáza rozlišovania: ü využitie génu, ktorý zabezpečuje výhodu ü (v prípade plazmidu pBluescript sa baktérie naočkujú na živné médium s obsahom ampicilínu -- baktérie, ktoré plazmid prijali prežijú, iné nie) Ü II. fáza rozlišovania: ü je potrebné odlíšiť bunky, ktoré prijali plazmid s cudzou DNA od tých, ktoré prijali nezmenený plazmid ü používajú sa tzv. reporter gény ü (gén pre a-peptid b-galaktozidázy, ktorý pri kultivácii na špeciálnom médiu zaisťuje tzv. modro-bielu selekciu) Prečo klonovať DNA? Ü Sondy Ü Sekvencovanie DNA Ü Transkripcia in vitro Ü Vytváranie rôzne upravených kombinovaných molekúl DNA (-> upravené proteíny -> liečebné účely) Ü ... Zhrnutie klonovania génov pomocou plazmidov Video Ďakujeme za pozornosť Ľubica Byrtusová Tomáš Buday