Anémie Anémie lze rozdělit: • Příznaky vznikající v důsledku poklesu transportu kyslíku do tkání ( únava, dušnost, angina pectoris, orgánové poruchy) • Příznaky vyplývající ze snížení plazmatického volumu (bledost, hypotenze) • Příznaky vyplývající ze zvýšeného srdečního objemu (tachykardie, srdeční šelest) Dle morfologických kritérií se anémie dělí na základě objemu erytrocytu, množství hemoglobinu v erytrocytu a počtu retikulocytů Anémie z nedostatku železa – sideropenické anémie: • z nadměrné ztráty železa – časté • nedostatečný příjem – vzácné • spíše inhibice vstřebávání způsobena např. fosfáty, oxaláty • malabsorpce při celiakii, Crohnově chorobě • v těhotenství – zvýšené nároky na přívod Fe • klinicky – únava, slabost, hučení v uších, dušnost Sideropenie - tři stádia – prelatentní, latentní a manifestní • Již v období prelatentního nedostatku železa se uplatňují kompenzační mechanizmy organismu • Zvýšená resorpce železa z GIT, snížení jeho výdeje a útlum tvorby zásobního proteinu Fe – feritinu • Zvýšena resorpce diagnostické dávky ^59Fe z 25% na 75% a snížen výdej Fe močí po jednorázovém podání desferioxaminu Terapie - léčba příčiny sideropenie - substituce Fe Anémie z nedostatku vitamínu B12 a kyseliny listové – megaloblastické • Označují se takto dle morfologického vzhledu erytrocytů • Nejčastější příčinou nedostatku vitamínu B12 je porucha vstřebávání • Způsobená buď nedostatkem vnitřního faktoru nebo výrazným omezením resorpční plochy ve střevě • Perniciózní anémie – nejčastější, postihuje vyšší věkové kategorie, genetické vlivy, autoimunitní onemocnění (protilátky proti buňkám žaludeční sliznice) • Vnitřní faktor – glykopeptid nutný při vstřebávání B12 v ileu Anémie z nedostatku vitamínu B12 a kyseliny listové – megaloblastické Prokázány dva typy protilátek – a) brání vazbě vit. B12 na vnitřní faktor b) inhibují vazbu komplexu vit. B12 - vnitřní faktor na receptory ve sliznici ilea Megaloblastická anémie • Vzniká i po resekci žaludku – většinou kombinace nedostatku vitamínu B12 a kyseliny listové ( ta se vstřebává v duodenu a horním jejunu) • Vitamín B12 tvoří prostetickou skupinu enzymu homocysteinmethyltransferázy, která demethyluje tetrahydrofolát a přenáší methylovou skupinu z homocysteinu na methionin • Tetrahydrofolát je následně opět methylován a je donorem methylové skupiny pro tvorbu thyminu • Důsledkem nedostatku vit. B12 a kyseliny listové je tedy porucha syntézy thyminových bází a tvorby DNA • Prodlužuje se S-fáze buněčného cyklu, při níž se zdvojnásobuje množství DNA, výsledkem je velký objem buňky s nezralým jádrem – megaloblast Anémie při chronickém onemocnění: • Chronické infekce (tuberkulóza, AIDS), zánětlivá onemocnění, nádory • Aktivace imunitního systému vedoucí k omezení nabídky železa invadujícím patogenům či nádorovým buňkám, pro něž Fe představuje zásadní růstový faktor • Stimulace tvorby feritinu spolu s blokádou uvolňování železa ze zásobárny Anémie ze zvýšeného zániku erytrocytů – hemolytické : • Charakteristická je zkrácená doba přežití erytrocytů v periferní krvi • Často ani maximálně stupňovaná krvetvorba není schopna nahradit zvýšený rozpad krvinek Hemolytické anémie: - Dědičná sférocytóza (porucha skeletu erytrocytární membrány – deficit spektrinu) - Anémie z poruchy enzymatické výbavy erytrocytu – př. deficit pyruvát kinázy - Anémie z poruchy tvorby hemoglobinu - beta-thalasemie - Autoimunitní hemolytické anémie – porucha kooperace mezi pomocnými a supresorovými lymfocyty T a B Vitamín B12 (cyanocobalamin): • Molekula B12 obsahuje jako centrální atom kobalt, který je umístěn uprostřed porfyritového jádra • Vitamín je nezbytný pro tvorbu nukleových kyselin, tedy pro dělení buněk • Nedostatek se projeví perniciózní anémií • Deficit je nejčastěji způsoben poruchou absorpce při chronické atrofické gastritidě, kdy žaludeční sliznice netvoří mukoprotein nezbytný pro vstřebávání vitaminu B12, tzv. vnitřní faktor • Ověření se provádí Schillingovým testem, kdy se sleduje absorpce vitamínu B12 po podání vnitřního faktoru Stanovení vitaminu B 12 ( sérum, plasma): • Komerční stanovení se zakládá na technikách stanovujících volný nebo vázaný vitamín B12 • Přítomnost endogenních sérových vazebných proteinů pro cyankobalamin ( transkobalaminy včetně R-proteinu) a imunoglobulinů namířených proti vnitřnímu faktoru vyžaduje pro uvolnění vitaminu B12 povaření materiálu nebo zpracování v alkalickém pH • Historie – imunochemické metody - v 70-tých létech se k stanovení vitaminu B12 pomocí RIA využívalo sérových vazebných proteinů a částečně vyčištěného vnitřního faktoru – výsledky byly často falešně zvýšené Stanovení vitaminu B 12 ( sérum, plasma): V současnosti: Vitamín B12 se stanovuje kompetitivním testem využívajícím vysoce čistého vnitřního faktoru specifického pro vit. B 12 po uvolnění z endogenních vazebných proteinů Imunochemické metody – např. • Elektrochemiluminiscence - Roche – Elecsys, E170 – Vit. B 12 ze vzorku soutěží s vit. B 12 značeným biotinem o vazebná místa na vnitřním faktoru značeným rutheniovým komplexem • Chemiluminiscence - Bayer – Centaur – Vitamín B12 ze vzorku soutěží s vitamínem B12 značeným akridinium esterem o limitovanou koncentraci vnitřního faktoru kovalentně vázaného na paramagnetické částice Po separaci chemiluminiscenční reakce s peroxidem vodíku a NaOH Referenční rozmezí: 150 – 650 pmol/l Folát (kyselina listová) • Tetrahydroderivát kyseliny listové je koenzymem metabolismu jednouhlíkatých zbytků • Uplatňuje se při řadě reakcí včetně tvorby nukleových kyselin • Nedostatek se projevuje podobně jako deficit vitaminu B12, tj. megaloblasticou anémií • Nedostatek velmi častý - je jednou z nejčastějších příčin mírné hyperhomocysteinémie (vliv na sklerotické a trombotické onemocnění periferních cév), u těhotných může zvyšovat frekvenci defektu neurální trubice plodu • Nedostatek může způsobit dieta bez čerstvého ovoce a zeleniny, objevuje se u alkoholiků, drogově závislých, nebo starších osob Stanovení folátu v séru (plasma není vhodná): Imunochemické metody Kompetitivní princip po uvolnění folátu z endogenních folát vázajících proteinů - např. elektrochemiluminiscence Roche – Elecsys, E170 - chemiluminiscence - Bayer – Centaur Folát ze vzorku soutěží s folátem značeným akridinium esterem o limitovaný počet molekul folát vázajícího proteinu značeného biotinem Tento protein se váže k avidinu na paramagnetických částicích Po separaci probíhá chemiluminiscenční reakce s peroxidem vodíku a NaOH Referenční rozmezí: 10 – 50 nmol/l Interference: Hemolýza výrazně zvyšuje koncentraci folátu, z hemolytických vzorků se proto stanovení neprovádí. Feritin • Zásobní vysokomolekulární bílkovina obsahující železo • Nachází se v játrech, slezině, kostní dřeni a střevní sliznici • Koncentrace feritinu v séru odráží tkáňové zásoby železa – její hladina klesá dříve než roste koncentrace transferinu • Zvýšení syntézy feritinu indukováno nedostatkem železa v organismu • Buňky některých nádorů, především akutní myeloblastická leukémie nebo mnohočetný myelom, produkují feritin - koncentrace feritinu jako tumormarker • Může být zvýšen rovněž u chronických zánětů a onemocnění jater Stanovení feritinu (sérum, plasma): Imunochemické metody Sendvičový princip - např. elektrochemiluminiscence - Roche – Elecsys, E170 - chemiluminiscence - Siemens – Immulite • Stanovení založeno na reakci jednoho epitopu ferritinu s myší protilátkou navázanou na polystyrénové kuličce a druhého epitopu s polyklonální protilátkou konjugovanou s alkalickou fosfatázou • Po promytí se přidá fosforečný ester adamantyl dioxetanu - ten s ALP hydrolyzuje na nestabilní meziprodukt • Meziprodukt se rozpadá za produkce luminiscence Stanovení feritinu (sérum, plasma): - fluorescenční imunoanalýza Kryptor – Brahms Dvě různé protilátky tvoří komplex s feritinem Jedna značena donorem energie - kryptát europia, druhá akceptorem XL 665 Po ozáření komplexu dusíkovým laserem donor emituje dlouhotrvající signál v ms, zatímco akceptor generuje signál v ns Obě komponenty svázány v jeden komplex - je možné signál měřit v ms Dochází rovněž k spektrálnímu posunu Velikost signálu je úměrná koncentraci stanovovaného analytu Referenční rozmezí: M 30 – 400 ug/l Ž 5 – 150 ug/l Transferin –Trf • Transportní protein pro železo v séru • Při nedostatku železa velmi citlivý indikátor saturace transferinu • Využívá se i při monitorování léčby anémie Stanovení transferinu (sérum, plasma) – imunoturbidimetricky imunonefelometricky – př. Roche Diagnostic – Protilátky proti transferinu reagují se stanovovaným transferinem za vzniku komplexu antigen-protilátka Reakce se provádí v přítomnosti NaCl a PEG Aglutinát se stanoví turbidimetricky Referenční interval:2 – 3,6 g/l Solubilní transferinové receptory – sTFR • Transferinový receptor je integrální membránový protein • Každá ze dvou podjednotek může vázat molekulu transferinu nesoucí železo • Učinkem proteolýzy vzniká rozpustná forma transferinového receptoru • sTFR je v plasmě přítomen v komplexu s transferinem • Koncentrace sTFR je úměrná koncentraci receptoru na membránách • Při deficitu Fe se koncentrace sTFR v séru zvyšuje • Na rozdíl od koncentrace ferritinu není koncentrace sTFR ovlivněna reakcí akutní fáze, nebo maligními nádory • Uplatňuje se v diferenciální diagnostice – rozlišení mezi chronickým onemocněním a anémií z nedostatku Fe Stanovení sTFR (sérum, plasma) – imunoturbidimetricky: Princip – př. Roche Diagnostic Částicemi usnadněné imunoturbidimetrické stanovení: • Lidský rozpustný transferinový receptor aglutinuje s latexovými částicemi, potaženými s protilátkou proti rozpustnému transferinovému receptoru • Precipitát se stanoví turbidimetricky Referenční interval: 2 – 5 mg/l