Nepřímá DNA diagnostika
Přímou DNA diagnostiku nelze nabídnout, přestože gen je znám, z důvodů:
•       velikosti genu ( gen pro dystrofin, gen pro neurofibromin)
•       existencí homologních pseudogenů
•       rozptýlením mutací v celé délce genu, nepřítomností tzv. "hot spot" míst v genu
Vazebná analýza je umožněna:
- v rodinách s dvěma a více jedinci s klinicky potvrzenou diagnózou
- rozlišením dvou chromozomů pomocí markerů na DNA
- přiřazením DNA markerů (tj. chromozomu) k patologii v rodině
Základní principy nepřímé DNA
diagnostiky:
1) odlišení dvou chromozomů rodičů (heterozygozyta markerů)
2) určení fáze (určení haplotypu -souboru alel polymorfních míst ve vazbě)
3) určení haplotypu (chromozomu) asociovaného s patologií v rodině
Využití polymorfních míst genomu v nepřímé DNA diagnostice
Polymorfní místa lidského genomu:
•  polymorfní DNA sekvence rozlišované specifickými restrikčními enzymy
•  tandemové repetice DNA, charakterizované bloky opakujících se DNA sekvencí. Podle velikosti opakujících se bloků rozlišujeme:
*  VNTR (variabilní počet tandemových repetic) - opakující se jednotky tvoří oblast o velikosti 100 - 6500 párů baží, často lokalizované extragenově
*   mikrosatelitní DNA - repetice 1-4 párů baží, nejčastěji lokalizované v nepřepisovaných částech genu tzv. intronech
Nepřímá DNA diagnostika
využívá znaky (markery) rozptýlené v lidském genomu vyskytují se běžně v populaci nejsou přepisovány do proteinu (leží v intronech) nejsou příčinou choroby
př. gen CFTR - intron 8 - polymorfní místo (CA)n----GTATCACACACATTCGG —
od otce
alela AI:
......GTATCACATTCGG-
od matky
alela A2:
.....GTATCACACACATTCGG-
délka alely 130 bp
délka alely 134 bp
ta    <ľ>
♦-1    >
cn
< o
<
^    <
00   ^
o  __
Ph    < *T3
	'S	tó
	>	H
	13	Ph
	s	U
		3 c
	c	(D
		hf
	<u	
	c	> (U ctí
Ö		2
o		n
Ö	m	
	«3	o
Ö		
o		
Ö	«3	
-Í
O
Ph <J
o
Ö Ö
o
in
(N «3
o
Ö 00
o in
Ph
t3

<
X	
(N	
^T	
in	^T
O	«3
00	^
o	i—1
in	<:
Ph	
T3	
Ö    <~n
B <
I 3
00    ^
O    ^H
Ph    ^
T3
Schéma: Lokalizace extra- a intragenních polymorfních míst genu CFTR (převzato M. Claustres eta!., Hum. Genet, 1996, 98:336-344)
kb
100             200             300             400
t        '■
CFTR
MARKER
EXONS       i            2 3
ŕíVŠŠ.
l^GATT
IVS6aY IVS8] (GATT)nA (CA)nJ
T854T\     / IVS17
(TA) (CA)n
17b\ f TUB20|
1
nm m
4 5     6     7 8 9    10   1 1 12 13 14   15 16 17  18      19 ab                                      ab             ab
4    *
AF508  G542X
21  22 23 24
í
N1303K
kb
50
100
150
200
230
b)   IVS8BTA
lis!2Si iss SŠSělliifi
M    1 =
150b p
100bp
legenda :
podmínky elektroforeticke separace:
50W / 55°C / 2 hod.
6% denaturační PAG (7M urea) barveno stříbrem
obr. 1: DNA analýza CF rodiny P. pomocí mikrosatelitních polvmorfních míst v intronech 17b a 8
(Morral N. etal., Hum. Genet 1992, 88:356, Morral N. et ai, Genomics, 1992, 13:1362-1364)
a) IVS17BTA
Mlisl2Iil2222^llíli
200bp
alely
5
4
150bp
*•
3 2
6

CT10
a
p-
Ä
nO

a
o cm
<  <N
S3
<u
ÖD 0>
-cö
-cd
Ö N D fí
^O
^
	<D
	'd
fí
O
Q*
I     Š
13
3
O
0í'
oo o in
T3
>
c--
>
< U m
oo
00    .
t/3
^
C/3
»-H O
o
Oh
£
I c
Rodokmen rodiny P
PAGE
III/l m/2 III/3 m/4 II/4   II/5   1/2
Využití poivmorfních míst v dvstrofinovém genu
.Recombination       1
. Frequency (%)
Locus       754
Exons
p84
•Ml
o.i
•*—►
XJ    p87

0.5
2.9      1,6
0.6
IVa»«
7   8 12
<------------k
STR44 STR45   STR50 STR49-
MP1P
;i(68
44     45
50
||------
79
Legenda:
•    5'(CA)n-alely 172 -184bp
.   pERT 87 - 8/ Tag I: alely 145bp (neštěpená, - alela) nebo 71 bp a 74 bp (Štěpená, + aíeia)
•    pERT 87-15/ BamHt: alely 216bp(neštěpená, - alela) nebo 166bp a 50bp (štěpená, + alela)
•    STR - sekvence /(CA)n/:       STR44 alely 174bp-204bp, heterozygozita 87%
STR45 alely 156bp - 184 bp, heterozygozita 89% STR49 alely 227bp - 257bp, heterozygozita 93% STR50 alely 233bp - 251bp, heterozygozita 71%
•    i68 /HinfJ: 4 alely
•    3'(CA)n: alely 131 bp-137bp

Rodina !. ( u probanda II /1 nebyla detekována delece v genu DMD)
+ T K R i -.	u K P						+ /^W-řyeamH I +  . a/ftŕag I ' STR 44 L            STR 45 STR 49 STR 50
A	A						B        4*C*
11.		É +			6 + -		
		T K R			+ u L P	U K P	
		A			J	A	
Využití intraaenového poivmorfismu STR49							
		U/1	U/2	1/1	M		
R
P'
															
															
															
i	o o														
1—	C>_														
9															
O)															
co															
CL															
O)															
:k															
ca															
o.															
a>															
a															
CM	o				-Ö										
O O C\l S2	CM.				S3 eS -o		eS -**			eS -** es					(U •**
■*					o		C/! (U			S					O
■					a		C/!								
m															
															
'2															
EL															
£															
l-															
E															
(0															
Ü															
CO															
CD															
C															
0)															
a	o CM.					^^j	E*		^^	J s					íl 1
						ŕA#      ^=rľ	|	i	^	1 5	--■			<	
					*	■t	5		S						
					>		N.			"S.					s,
							O		______     _^J	O					O
		#0Í»			1		LD a:		t       —'						CC (-to
									/£*£              ^						
					LO		LT)			lo					LO
					cn		CTJ			Oí					O)
					s		V,			"v					■N.
					co		01			O					^
					co		CO			ffl					en
					■^		■s			■v.					v.
					co		T			LO					cx>
					^—		^—			T------					^-
					a>		<u			O					v
co i	O				Q.		Q.			Q-					a
	<M.				E ra		E CD			E CO					E
c CO o					C/l		CO			CO					C0
					m		cä			CO					00
03					co		t			LO					CO
Cd i—					i—		r—			■—					r—
0)															
O					B		n			B					B
• S					B		n			n					B
		i i 'r l o    o		■    1    ■    1		■ i  i   |  i  | i j i | u    u    o    ej    u		11 CJ	1   1  '  1 ■ 1  '  1 cj   cj>   cj   u		■ i	1   1	■  i CJ	1   l   '   l CJ      t)	
ss		O    O	O	O		o   o   o   o		o	o   o   o		o	o	O	O	
		CM      *t	CD	co		C\J     «f    CD    CO		Í\J	í    lí    CO		M	*t	CO	CO	
<SZ		r-   Ln	CO	1		r««.    ir>   cm   t-		N	iň   rt   i-		N	m	to	"