RNA diagnostika RNA savčí buňka: • 10-30 pg celkové RNA • rRNA (28S.18S, 5S) 80-85 • tRNA, snRNA 15-20 • mRNA 1-5C 360 000 mRNA molekul/buňku, tj. 12 000 rozdílných transkriptů typická délka 1 transkriptů cca 2kb Analysis of Total RNA 80-85% 15-20% 1-5% Figure h Formaldehyde agarose gel of toia/ RNA isolated from the indicated sources using RNeasy kits. 10 yg SNA was loaded per lane Toblp 3 mRNA classification based on abundance Abundance class Copies/cell Low Intermediate High 5-15 200-400 12,000 Number of different messages/cell 1 1 ,000 500 <10 Abundance of each message <0.004% <0.1 % 3% Nestabilita RNA přítomnost ribonukleáz (RNázy) v buňce RNázy - velmi stabilní - nevyžadují kofaktory - účinné v nízkých koncentracích - obtížná inaktivace - kontaminace RNázami: lidská pokožka prachové částice (bakterie,plísně) izolace a analýza RNA : speciální přístup i techniky expresi vzorku Pa zpracování biologického vzorku: v okamžiku odběru se stává - dva hlavní typy artefaktů: 1) specifických i nespecifických druhů mRNA (downregulace genů a enzymatická degradace RNA) 2) exprese určitých genů ve vzorku při odběru : - okamžité zmrazení v tekutém dusíku a uložit při -80°C - stabilizační roztoky: RNAlater (tkáně), RNAprotect (bakterie), PAXgene (krev, kostní dřeň) E - PCR primery překrývající hranici intron/exon - štěpení DNázami - cílená izolace mRNA může být uložena při -20 nebo -70°C (bez degradace RNA po 1 roce uložení) RNA v diagnostice přímá RNA diagnostika - skrínování celé kódující oblasti příslušného genu gene - expresní analýza: - diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) - detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta - monitorování průběhu léčby a detekce reziduálni choroby - kontrola štěpu před autologní transplantací - differential display, PTT test, funkční testy.... Přímá RNA diagnostika Struktura NF1 genu - 350 kb - 60 exonů -11 -13kbmRNA - protein neurofibromin -2818 aminokyselin - zřejmě tumor supresor 1¥* Vk\ ^%w iwwnw (^"l jy« ?is« o\ ty« Viti *"" "8I\ *V5 **" ¥*TF*l ^BW' IS) IV Vř* ^ W6 Vfti\ wwwtÄf tJJJ 7B(614bp) P7 A (560bp) P" mt C5242T L wt C62 wt C62 podmínky elektroforetické separace : 12% PAGE (60:1) / 150V/16 hod. / r.t. Výhody a nevýhody RNA dignostiky -jednodušší a rychlejší skríning multiexonického genu (10 segmentů cDNA místo 60 exonů), mRNAje bez intronů - záchyt sestřihových mutací v intronech - záchyt delece celého exonu na jedné alele genu - nižší ekonomické náklady - složitější odběr krve pro izolaci RNA - nižší stabilita RNA - dlouhé úseky genu NF1 ■ obtížnější elektroforetická separace a sekvenace - nejasný efekt mutace na fenotypové úrovni (stejné u DNA diagnostiky!) Strategie detekce exprese genu ^Izolace mRNA (PB, BM, tkáň nádoru) XRT-PCR =^cDNA ^PCR => syntéza úseku DNA odpovídajícího mRNA pro TH => syntéza DNA pro ßuG (provozní gen) - kontrola kvality RNA a RT ß-ELFO - 5% PAGE, barvení stříbrem ~ Fragmentační analýza (ABI PRISM) "^Stanovení citlivosti =^> RNA izolovaná z NB buněčné linie IMR-32 Molekulární markerv neuroblastomu Tkáňově specifická exprese TH genu - buňky NB Vysoká citlivost detekce(~1 b./104-5) Detekce v KD, periferní krvi - cirkulující buňky NB Nádorově specifická exprese buněčných antigénu MAGE, GAGE kombinací více molekulárních markem je možno postihnout heterogenitu NB- zvýší se pravděpodobnost záchytu NB možnost zavedení a aplikace DNA vakcín Klinicky vyznám: ^ stanovení diagnosy ^ určení prognosy ^ sledování průběhu onemocnění (MRD, relaps) ^ detekci NB buněk v transplantátu před autologní transplantací RNA diagnostika neuroblastomu 1) Detekce exprese TH genu Tyrosinhydroxyláza 1.enzym dráhy syntézy katecholaminů katecholaminy - důležité neurotransmitery a hormony, regulují vnitrní funkce a motorickou koordinaci -jsou sekretovány 98% NB (NB je endokrinně aktivní) -jejich metabolity používány pro sledování průběhu onemocnění exprese TH genu je regulována tkáňově specificky během neonatálního vývoje a diferenciace 2) Detekce exprese genů MAGE a • Genové rodiny • Kódují nádorové antigény • Jejich produkty (vázané na MHC) jsou rozpoznávány cytotoxickými T lymfocyty • Exprimovány širokým spektrem lidských nádorů (NB, melanom, Synovial sarkom, NF1, k.plic, žaludku, prsu...)