Bílkoviny CB v séru, plasmě, moči a likvoru: • Mezi základní biochemická vyšetření patří stanovení celkové bílkoviny. Hlavní skupiny bílkovin tvoří albumin (asi 50%) a globuliny • Albumin je tvořen převážně v játrech. Udržuje stabilní onkotický tlak (podílí se na něm ze75%) a má významné transportní funkce • Globuliny - patří tam různé typy proteinů, které dělí na alfa, beta a gamaglobuliny. Globuliny jsou syntetizovány také v játrech, nebo jsou tvořeny imunitním systémem Celková bílkovina • Speciální preanalytické požadavky: nejsou • Referenční rozmezí: S/P 64-83 g/l moč 0-0,15 g/l likvor 0,15-0,45 g/l • TMU (toleranční rozpětí): S 4,0% Celková bílkovina Metody stanovení: • Referenční metoda: reakce s biuretovým činidlem ( pro CB v séru ) • Certifikovaný referenční materiál: NIST/SRM 927a ( pro CB v séru ) • Doporučené rutinní metody: reakce s biuretovým činidlem ( pro CB v séru ) Fotometrické metody Metoda s biuretovým činidlem : • Závisí na přítomnosti peptidových vazeb ve všech proteinech • Doporučená metoda ke stanovení celkové bílkoviny v séru a plasmě • Peptidové vazby reagují v alkalickém prostředí s roztokem mědnaté soli a tvoří fialově zbarvený komplex nedefinovaného složení • Komplex je vhodný k fotometrickému stanovení při 540 – 550 nm • Biuretová reagencie dále obsahuje: - tartarát sodno-draselným ke komplexaci měďnatých iontů a zabránění vysrážení hydroxidu měďnatého - jodid draselný - antioxidant - zabraňuje autoredukci mědi alkalické protein + Cu ^2+ --------------® Cu- protein complex prostředí Celková bílkovina v séru a plasmě Metoda s biuretovým činidlem– pokračování: • Barevný chelát vzniká mezi Cu ^2+ a látkou, která obsahuje alespoň dvě H[2]N-C-, H[2]N-CH[2]-, CH[2]-, H[2]N-CS- skupiny spojené přímo nebo přes C nebo N atom • Měďnatý iont je vázán koordinační vazbou k šesti peptidovým vazbám • Aminokyseliny a dipeptidy nereagují. Malé peptidy dávají růžové zbarvení, ale vzhledem k jejich nízké koncentraci v séru je jejich příspěvek nevýznamný. • Intensita zbarvení je úměrná počtu peptidových vazeb • Detekční limit bývá kolem 2 g/l • Interference: Hemolýza a lipémie vadí až při vysokých koncentracích ( hemoglobin reaguje jako protein) Fotometrické metody Metody využívající vazbu proteinu na barvivo: - Pyrogallolová červeň, Coomassie blue - stanovení v moči a likvoru - přestávají se používat Nevýhody: • nedostatečná stabilita činidla • nerovnoměrná schopnost vazby na barvivo pro různé typy bílkovin • falešné snížení koncentrace globulinů Fotometrické metody • Přímá fotometrie v UV oblasti (měření absorpce světla při 280 nm, které závisí na přítomnosti aromatických kruhů tyrosinu a tryptofanu), oxidoredukční Lowryho metoda nebo refraktometrie - v současné klinické biochemii nemají význam Turbidimetrické metody: Stanovení s benzethonium chloridem: • Koncentrace celkové bílkoviny o dva řády nižší • Využívají se citlivější metod Doporučená metoda • Celková bílkovina reaguje s benzethonium chloridem za vzniku zákalu, který se měří turbidimetricky při 505 • Reakce probíhá v alkalickém prostředí v přítomnosti EDTA, který denaturuje bílkovinu a eliminuje interferenci hořečnatých iontů • Výhoda metody - podobná reaktivita činidla s albuminem a gama globuliny - peptidy s krátkým řetězcem neinterferují Turbidimetrické metody: • Metoda využívající precipitace bílkovin s kyselinou trichloroctovou nebo sulfosalicylovou: - vykazuje nestabilitu nebo flokulaci precipitátu a také rozdíly v chování činidla k jednotlivým bílkovinám ve směsi - je nezbytně nutné nepoužívat kalibrátor na basi albuminu, ale zahrnující spektrum bílkovin tak, jak se vyskytují v moči Další metody Metoda s kyselinou sulfosalicylovou: jako doplňující zkumavkový test pro semikvantitativní stanovení bílkoviny při chemické analýze moče pomocí diagnostických proužků, které zachycují pouze albumin a nikoliv lehké řetězce Metody založeny na schopnosti proteinů vázat barvivo – např. Amido čerň, kyselou violeť Využívají se zejména k barvení po elektroforetickém rozdělení Další metody Kjeldahlova metoda: • Historicky nejstarší metoda ke stanovení celkové bílkoviny • Založena na mineralizaci vzorku s kyselinou sírovou a vydestilování amoniaku do předlohy s kyselinou • Dojde k přeměně bílkovinného dusíku na amonnou sůl • Její koncentrace se pak stanoví titrací s hydroxidem sodným • Výsledek se koriguje o dusík nebílkovinné povahy ( tato hodnota se získá po vysrážení bílkovin s kyselinou trichloroctovou) • Nedá se automatizovat, tudíž se v laboratořích klinické biochemie nepoužívá • Má význam při definování referenčních materiálů pro biuretovu metodu Albumin • Analyzovaný materiál: sérum, plasma, moč, likvor • Speciální preanalytické požadavky: nejsou • Referenční rozmezí: S/P 34-48 g/l moč 0-30 mg/l likvor 120-300 mg/l • TMU: S 4,2% Albumin v séru • Ve slabě kyselém prostředí se albumin chová jako kation • Stanovení založeno na reakci s aniontovým barvivem většinou se skupinou – SO[3]H • Využívají se barviva, která se specificky vážou na albumin v přítomnosti ostatních sérových bílkovin • Nutný posun absorpčního maxima komplexu albumin-barvivo proti absorpčnímu maximu samotného barviva Stanovení albuminu s bromkresolovou zelení (BCG) v séru a plasmě: • Žlutozelený roztok bromkrezolové zeleně tvoří při pH 4,2 s albuminem zelenomodrý komplex s maximem 630 nm • Vazba albuminu na barvivo není zcela specifická - barvivo částečně reaguje také s a1 - a a2-globuliny, ale pomaleji než s albuminem • Nespecifickou vazbu minimalizuje odečítáním absorbance krátce (30s) po smíchání séra s barvivem • Jedná se o nejčastěji používanou metodu Stanovení albuminu s bromkresolovým purpurem (BCP) v séru a plasmě : • Žlutý roztok bromkrezolového purpuru tvoří při pH 5,2 za přítomnosti povrchově aktivních látek s albuminem zelený komplex – maximum 600 nm • Metoda je vysoce specifická Stanovení albuminu v séru a plasmě • Referenční metoda – neexistuje • Historicky používaná metoda s methyl oranží -vzhledem k nežádoucím interferencím se nepoužívá Albumin v moči • Podobně jako při stanovení CB se jedná o mnohem nižší koncentrace než v séru Imunoturbidimetrie nebo imunonefelometrie • Se specifickou protilátkou proti lidskému albuminu tvoří albumin precipitát imunokomplexu • Vzniklý zákal se měří imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky Dříve se ke stanovení albuminu v moči používala metoda ELISA nebo RIA Stanovení dalších proteinů • Další proteiny přítomné v séru v nízkých koncentracích se převážně stanovují imunoturbidimetricky nebo imunonefelometricky • Pro stanovení v séru a moči postačuje imunoturbidimetrie, pro stanovení v likvoru je pro svou citlivost vhodná imunonefelometrie • Historicky - reakce na agarose s obsahem protilátky Radiální imunodifuze – po obarvení kroužky Elektroimunodifuze (elfo + imunoreakce současně) - raketky CRP v séru a plasmě • C-reaktivní protein - nejčastěji stanovovaný velmi citlivý protein akutní fáze • Jeho koncentrace se prudce zvedá při zánětu • Není specifický • Stanovuje se většinou imunoturbidimetricky • Existují metody pro stanovení supersenzitivního CRP (pro novorozence, kardio) stanovované např. luminiscenční analýzou -v praxi se neprosadily • Rozšířené jsou metodiky na stanovení širokospektrálního CRP s mezí stanovitelnosti kolem 1 mg/l • Imunoturbidimetrické stanovení zesílené na částicích (particle-enhanced) – antigen (CRP) reaguje a protilátkou proti CRP, která je navázaná na latexových mikročásticích. Vzniklý komplex – precipitát se stanoví turbidimetricky Imunoglobuliny v séru (plasmě) a likvoru Imunoglobuliny v séru a likvoru • dostatečnou citlivost mají pouze imunochemické metody Imunoglobuliny G, A a M v séru či plasmě - stanovují se imunoturbidimetricky (imunonefelometricky) v likvoru pouze imunonefelometrie (dostatečná citlivost) • Imunoturbidimetrické i turbidimetrické metody jsou založeny na měření zákalu vytvořeného interakcí měřeného analytu se specifickou protilátkou • Vznik precipitátu se projevuje vzrůstem zákalu reakční směsi • U imunoturbidimetrických metod reakce často probíhá v přítomnosti PEG, který zvyšuje rychlost reakce, citlivost a výrazně omezuje možnost rozpouštění precipitátu v přítomnosti nadbytku antigenu • Hlavní vlnová délka pro měření absorbance - 340 nm Imunoglobuliny • Analýza jednotlivých polyklonálních imunoglobinů zahrnuje stanovení koncentrace směsi proteinů různé velikosti s podobnou konstantní částí a různou variabilní částí • Protilátky a referenční kalibrátory jsou postaveny proti normálním lidským sérům složeným ze směsi imunoglobulinových podtříd • Stanovení jednotlivých polyklonálních imunoglobinů - spolehlivé Imunoglobuliny • Stanovení monoklonálních imunoglobinů – problematické • Monoklonální imunoglobiny mají pouze některé z determinant, s kterými protilátky v antiséru reagují • Dochází k rychlé tvorbě precipitátu, pro vysoké koncentrace monoklonálních imunoglobinů (paraproteinů) jsou výsledky získané zejména po naředění nadhodnoceny • Pro absolutní koncentraci paraproteinů - elektroforéza a denzitometrie • Imunochemické metody lze využít ke sledování změny koncentrace téhož paraproteinu Imunoglobuliny D a E Imunoglobuliny D a E v séru • Vyžadují ke stanovení ještě citlivější analytické metody • Obvykle se využívají imunoanalyzátory na principu chemiluminiscence Další proteiny: • Prealbumin a transferin - velmi četné stanovení - v séru (imunoturbidimetricky) a likvoru (imunonefelometricky) • Orosomukoid, Haptoglobin v séru (imunoturbidimetricky) a likvoru (imunonefelometricky) • Alfa 1 – antitrypsin, Proteiny komplementu C3 , C4 v séru (imunoturbidimetricky) • Alfa 2 – makroglobulin v séru a moči, Alfa 1 – mikroglobulin v moči (imunoturbidimetricky) • Ceruloplasmin – imunonefelometricky v séru – zejména pro monitorování Wilsonovy choroby nutná velmi citlivá metoda Volné lehké řetězce k a l • Imunoglobulinové molekuly : - dva těžké řetězce ( a,d,e,g nebo m, které určují imunoglobulinovou třídu) - dva identické lehké řetězce - každý lehký řetězec je kovalentně navázán na těžký řetězec - těžké řetězce jsou kovalentně spojeny v stěžejní část • U zdravých jedinců je koncentrace volných lehkých řetězců minimální • Volné lehké řetězce kappa existují v séru převážně jako monomery a řetězce lambda jako dimery • Proto různý poměr u glomerulární filtrace • V séru je poměr volných kappa ku lambda 0,625 zatímco poměr vázaných volných lehkých řetězců je 2 • Ke stanovení se používá imunonefelometrická případně imunoturbidimetrická metoda Nízkomolekulární proteiny či polypeptidy Prokalcitonin – polypeptid, prekurzor hormonu kalcitoninu • Tvorba je stimulována výlučně bakteriální a mykotickou infekcí (bakteriální meningitidy, sepse) • Stanovení v na principu luminometrie Cystatin C – polypeptid, jeho koncentrace stoupá úměrně poklesu glomerulární filtrace • imunonefelometricky v séru se specifickou protilátkou chemicky vázanou na polystyrénových částicích (Particle-Enhanced Nephelometry) Beta2 – mikroglobulin v séru - luminiscence Další bílkoviny • Není zde pojednáno o dalších parametrech, které sem patří složením • Vzhledem k diagnostickému významu jsou zařazeny jinde ( např. ferritin, volný hemoglobin, glykovaný hemoglobin, fruktosamin, C – peptid)