Parametry metod automatické analýzy Parametry definují analytickou metodu. Zadávají se do automatických analyzátorů takto: • ruční zadání jednotlivých parametrů ( ustupuje, možnost chyby) • kompletní aplikace od výrobce – instalace z diskety, čárovým kódem nebo přes web, možnost úpravy pouze u některých parametrů Minimální reakční objem: • významná charakteristika analyzátoru • Odvíjí se od něj cena za analýzu jednoho testu (100 – 180 ul - pro R1 činidlo) • Některé stroje reagencie předřeďují. Pracují pak s menším objemem a minimálními náklady (Avia 1650, Siemens) Minimální pipetovací objem – 2 ul: • Minimální objem se týká vzorku, kontrolních a kalibračních materiálů • Reagencie jsou pipetovány proti vzorku většinou minimálně v desetinásobném nadbytku • Při potřebě provést analýzu z menšího objemu vzorku (ředění) se vzorek předředí Příklady parametrů používaných u automatické analýzy: Analyzátor na klinickou chemii: • Minimální reakční objem: 180 µl • Objem vzorku: 2 – 35 µl • Vlnové délky: 340, 376, 415, 450, 480, 505, 546, 570, 600, 660, 700, 800 nm • Reakční teplota: 37°C • Reakční čas: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 minut Stanovení ISE: • Metody: Na, K, Cl • Objem vzorku: 15 µl • Objem diluentu:: 450ul/vzorek • Ředění: 1 : 31 • Objem vnitřního standardu: 1050 ul/vzorek • Referenční roztok: 130 ul/vzorek Vlnové délky, bichromatické měření: Všechny testy pro klinickou chemii jsou v současné době měřeny simultánně při dvou vlnových délkách – hlavní a vedlejší. Bichromatické měření Koncentrace se počítá z rozdílu absorbance obou měření. Výhodné, neboť kompenzuje : • variace světelné emise fotometru • citlivost fotodiod • bublinky nebo částečky v cestě světla Hlavní vlnová délka je dána absorpčním maximem reakce Vedlejší vlnová délka je zvolena tak, aby • rozdíl absorbancí mezi hlavní a vedlejší λ byl co největší • současně co nejblíže k hlavní λ Na analyzátorech bývá běžně možnost využívat pro různé metody 12 vlnových délek Pořadí přidávání reakčních komponent: Existují dva typy pipetování • 1. Nejdříve se pipetuje vzorek (jehla se musí dotknout dna) a potom činidlo - př. analyzátory řady Hitachi, Roche • 2. Nejprve se pipetuje činidlo (výplach jehly vodou), potom vzorek – př. analyzátory Integra, Roche • V obou případech jsou jednoreagenční metody označovány jako „Sample start“ a dvoureagenční jako „Substrate start“ Měřící body reakce: • Absorbance reakčních roztoků v kyvetě je periodicky měřena po každém cyklu přístroje (kolem 20s) během reakčního času ( 3 – 10 minut) • Přístroje jsou schopny přidávat vzorky a činidla v určité fázi reakčního času dle typu prováděné reakce • Přesná specifikace měřícím bodem Typy měření: End point – jednobodové (měří se absorbance na konci reakce) End point - dvojbodové (blank + konec reakce) Kinetické (rate) – měří se změna absorbance za časovou jednotku Při reakci dochází k nárůstu (stanovení CK) či poklesu absorbance (stanovení ALT, AST) Způsoby kalibrace: Automatické analyzátory umožňují např. tyto typy kalibrace: • Lineární dvoubodovou • Nelineární Logit-log 3P • Nelineární Logit-log 4P • Nelineární Logit-log 5P • Nelineární exponenciální • Nelineární Spline • Isoenzym P • Isoenzym Q • Nelineární Point to Point • ISE (tříbodová) Ověření integrity výsledku: • Aby se zabránilo vydání nesprávného výsledku při extrémní koncentraci, analyzátory automaticky provádí zkoušky na ověření správnosti výsledku • Není-li výsledek po technické stránce v pořádku, je označen chybovým hlášením a ve většině případů automaticky naředěn • Používají se následující zkoušky: Test detekující Hook efekt , test na linearitu, test na dodržení absorbančního limitu Test detekující Hook efekt -při nadbytku antigenu u imunoturbidimetrických stanovení (Prozone Check) -koncentrace antigenu je tak vysoká, že dochází k rozpouštění precipitátu Test detekující Hook efekt • Objevuje se u imunoturbidimetrických stanovení • Koncentrace ve vzorku vysoká • Leží na pravé straně Heidelbergovi křivky • Chybně stanovená nízká koncentrace měřením absorbance je s využitím Prozone Check detekována a označena chybovým hlášením • Stanovení je pak znovu provedeno z menšího objemu nebo z naředěného vzorku • Prozone Check je nejčastěji proveden následovně: Po skončení reakce se stoupající směrnicí absorbance je přidán další definovaný objem antigenu. Absorbance je měřena před i po přidání antigenu (viz 1-Point Assay) Test na linearitu • Je prováděn automaticky u všech kinetických metod • Linearita je kontrolována pomocí lineární regresní analýzy. Není-li splněna, vzorek je označen chybovým hlášením (př. Lin.) Test na dodržení absorbančního limitu • Naměřená absorbance vzorku je tak vysoká, že nelze zajistit spolehlivé výsledky • U vzorků se objeví chybové hlášení (př. Lim 1) a musí se ředit • Integrita výsledku je zajištěna nastavením absorbančního limitu Test na kontrolu vyčerpání substrátu • Uplatňuje se absorpční limit i kontrola linearity • Není-li reakce lineární, do výpočtu jsou zahrnuty pouze body z lineární oblasti Technický limit – výsledky, které leží mimo technický limit jsou označeny chybovým hlášením a nesmí být vydány dokud nejsou zopakovány - nejčastěji po naředění Repeat limit – výsledky jsou technicky správně, jsou pouze mimo limit zvolený laboratoří pro opakování Možnost korekce na nespecifické výsledky • Existuje možnost vložit korekční faktory – např. pro kreatinin, kdy se u Jaffého metody projevuje vliv reakce proteinů Sérové indexy: • U metod, které využívají kinetické měření, lze stanovit stupeň potenciální interference způsobené bilirubinem, hemoglobinem nebo lipémií - tzv. sérové indexy • Test je založen na měření naředěných vzorků při různých vlnových délkách Sérové indexy