Základy klinické cytogenetiky Hanáková M. Shrnutí přednášky • základní pojmy klinické cytogenetiky - chromozom, mitóza, karyotyp, třídění chromozomů • metody klasické cytogenetiky – odběr materiálu, kultivace, zpracování, pruhování, barvení • vrozené chromozomové aberace, meióza a poruchy v meióze, získané chromozomové aberace, příklady využití v klinické cytogenetice • metody molekulární cytogenetiky, příklady využití v klinické cytogenetice • nádorová cytogenetika • preimplantační genetická diagnostika Základní pojmy klinické cytogenetiky DEFINICE A HISTORIE • klinická cytogenetika se zabývá analýzou chromozomů (jejich počtem a morfologií), jejich segregací v meióze a mitóze a vztahem mezi nálezy chromozomových aberací a fenotypovými projevy. • vznik moderní lidské cytogenetiky se datuje od roku 1956, kdy Tjio a Levan vyvinuli efektivní metodiky chromozomální analýzy a stanovili, že normální počet lidských chromozomů je 46. JADERNÝ MATERIÁL • chromatin – komplex DNA s chromozomovými proteiny a RNA (pojem používaný pro interfázi) • chromozom – chromatin spiralizovaný v mitóze • chromatida = 1 kontinuální molekula dvoušroubovicové DNA ve vazbě s chromozomovými proteiny a RNA (spiralizovaná v mitóze) Jestliže chceme vysledovat osud chromatid chromozomu v interfázi, hovoříme o "chromatidách" i v despiralizované podobě. Chromozom se skládá z 1 nebo 2 chromatid (v různých fázích spiralizace) v závislosti na fázi buněčného cyklu CHROMATIN • euchromatin - dekondenzovaná forma chromatinu - transkripčně aktivní chromatin (přepis genů do RNA) • heterochromatin - kondenzovaná forma chromatinu - transkripčně inaktivní chromatin (ale replikace probíhá) konstitutivní heterochromatin - zůstává v kondenzovaném stavu a nepřepisuje se do RNA v průběhu celého buněčného cyklu ve všech buňkách a ve všech vývojových stádiích organizmu - transkripčně trvale inaktivní - centromery, - chromocentra = oblasti konstitutivního heterochromatinu v interfázi fakultativní heterochromatin - může přecházet ze stavu heterochromatinu do stavu euchromatinu CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU buněčný cyklus somatických buněk (interfáze + mitóza) - G1, S, G2 fáze = INTERFÁZE nejdelší fáze buněčného cyklu, chromatin je málo kondenzovaný nebo dekondenzovaný (pouze konstitutivní heterochromatin zůstává trvale kondenzován) - M fáze = MITÓZA buněčné dělení – kondenzace chromatinu, vznik chromozomů CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromozomů během buněčného cyklu se chromatin nachází v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký stupeň spiralizace, během mitózy postupná kondenzace, maximální v metafázi mitózy) CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU- interfáze buňka v interfázi (v jádře málo kondenzovaný a dekondenzovaný chromatin) CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU- metafáze mitózy metafázní chromozomy ve světelném mikroskopu (chromozomový rozptyl, pracovně mitóza) zvětšení 1250x CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU interfáze G1 fáze každý chromozom je tvořen 1 chromatidou S fáze = syntetická fáze každý chromozom se zdvojí (zreplikuje), tzn. je tvořen dvěma chromatidami G2 fáze každý chromozom je tvořen dvěma chromatidami CHROMATIN A CHROMOZOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU mitóza M fáze = MITÓZA postupná kondenzace chromatinu až do maxima v metafázi, vznik chromozomů (chromozomy tvořeny dvěma chromatidami) oddělení sesterských chromatid v centromeře v anafázi (chromozomů je dvojnásobný počet a jsou tvořeny jednou chromatidou) – podélné dělení centromery segregace dceřinných chromatid (samostatných chromozomů), pohybují se k protilehlým pólům buňky mitóza je dokončena cytokinezí - rozdělením cytoplazmy původně mateřské buňky za vzniku dvou dceřinných buněk, jejichž jádra obsahují stejnou genetickou výbavu jako buňka mateřská (dělení buňky) CHROMOZOM tyčinková organela CHROMOZOM • centromera = heterochromatinová oblast (konstitutivní heterochromatin), místo rozdělení krátkých a dlouhých ramének, místo spojení sesterských chromatid, místo tvorby kinetochorů v meióze a mitóze, (primární konstrikce) • telomera = specifická DNA sekvence na koncích každého chromozomu (každé chromatidy), která zajišťuje integritu chromozomu během buněčného dělení (repetitivní hexamer (TTAGGG)n) CHROMOZOMY V PRAXI dvouchromatidový metafázní chromozom v preparátu vhodném pro naše účely jsou sesterské chromatidy těsně u sebe, chromozom se jeví jako 1 tyčinka CHROMOZOMY V PRAXI karyotyp • soubor chromozomů jedince nebo buňky s označením jejich počtu, druhu pohlavních chromozomů a případných aberací (zápis karyotypu např. 46,XX) • běžné označení pro soubor metafázních chromozomů buňky uspořádaných podle standardní klasifikace • lidský karyotyp se skládá ze 46 chromozomů, z toho 22 párů autozomů (nepohlavních chromozomů) a 2 gonozomů (pohlavních chromozomů) • chromozomový pár je tvořen homologními chromozomy, z nichž jeden je zděděn od otce a druhý od matky, nepárové chromozomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) CHROMOZOMY V PRAXI normální karyotyp CHROMOZOMY V PRAXI třídění chromozomů podle umístění centromery • metacentrické chromozomy centromera téměř nebo úplně uprostřed, tedy krátká a dlouhá raménka jsou (téměř) stejně dlouhá • submetacentrické chromozomy centromera mimo střed chromozomu, p a q raménka jsou jasně délkově odlišena CHROMOZOMY V PRAXI třídění chromozomů podle umístění centromery • akrocentrické chromozomy centromera je umístěna velmi blízko jednomu konci; od krátkých ramének jsou odškrceny satelity (malé výrazné části konstitutivního heterochromatinu; místo odškrcení = sekundární konstrikce (tenké stopky) CHROMOZOMY V PRAXI třídění chromozomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY Metody klasické cytogenetiky CHROMOZOMY V PRAXI odběr materiálu Odběr materiálu pro účely cytogenetického vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) • do heparinu a transportního média – kostní dřeň (obv. 1-2 ml) • do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) • bez přídavku média a dalších látek – plodová voda (obv. 20 ml) CHROMOZOMY V PRAXI odběr materiálu Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních chromozomů : • periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty • fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé T-lymfocyty • plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní fibroblasty • choriové klky – z chorionu nebo placenty - buňky choriových klků nebo placenty • kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní fibroblasty • kostní dřeň – z prsní kosti, kyčlí – prekurzory krevních buněk • solidní tumory – z nádoru – maligní buňky CHROMOZOMY V PRAXI odběr materiálu CHROMOZOMY V PRAXI kultivace materiálu • kultivace v médiích určených pro konkrétní typ materiálu (živiny, růstové faktory, antibiotika, přídavek speciálních přísad pro určitý typ materiálu, apod.) • délka kultivace - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) - 48 hodin (stanovení ZCA) kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci chromozomů nebo k zániku buněk s aberací - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) - choriové klky – přes noc (stanovení karyotypu) - kostní dřeň – přímé zpracování buněk ihned po odběru - 24 hodin (48 hodin spec. případy) (stanovení karyotypu maligních klonů v KD) - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) - solidní tumory – minimálně 3 týdny (stanovení karyotypu maligních klonů v tumoru) CHROMOZOMY V PRAXI kultivace materiálu • kultivace buněk v suspenzi (periferní krev, fetální krev, choriové klky, kostní dřeň) • kultivace buněk přichycených na dně kultivační nádobky (plodová voda, solidní tumory, kůže) - po kultivaci pomocí roztoku trypsinu odloupneme ode dna, dále zpracováváme jako suspenzi buněk CHROMOZOMY V PRAXI kultivace materiálu CHROMOZOMY V PRAXI zpracování suspenze buněk • aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) - zastavení dělení buněk v metafázi mitózy - kolchicin je mitotický jed, který specificky inhibuje dělící vřeténko a tím zastavuje dělení buněk v metafázi mitózy, kdy jsou chromozomy vhodné k analýze • hypotonizace – lýza erytrocytů • fixace - náhlé a trvalé zastavení veškerých životních pochodů buňky, odvodnění, rozpuštění cytoplazmy CHROMOZOMY V PRAXI zpracování suspenze buněk • vykapání suspenze buněk na podložní sklíčko CHROMOZOMY V PRAXI barvení / pruhování chromozomů • barvení (analýza ZCA) – Giemsovým barvivem (bez pruhování chromozomů, obarvuje chromozomy po celé délce, viz kapitola „Získané chromozomové aberace”) • pruhování chromozomů (analýza karyotypu, karyotypu maligních klonů) • speciální barvení – „C”- vizualizace heterochromatinu - dovyšetření nálezů na chromozomech (VCA) CHROMOZOMY V PRAXI pruhování a speciální barvení chromozomů • pruhovací metody umožňují individuální diferenciaci jednotlivých chromozomů (byly zavedeny v letech 1968 -71) • do té doby bylo možné pouze obarvit chromozomy barvivem – orcein, karbolfuchsin, Feulgenovo barvivo a seřadit je do skupin podle velikosti a poměru krátkých a dlouhých ramének CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů G - pruhování • nejčastěji rutinně užívaná metoda • chromozomy jsou vystaveny účinkům trypsinu (proteolytický enzym), který natráví chromozomové proteiny • chromozomy obarvíme Giemsovým barvivem (směs barviv) • výsledek – každý chromozom se specificky obarví (střídavé tmavé a světlé proužky různé tloušťky, tmavé proužky jsou bohaté na adenin a thymin, světlé na cytozin a guanin) • získané pruhy jsou specifické pro každý chromozomový pár • lze snadno rozpoznat strukturní a numerické abnormality • 1 pruh na chromozomu obsahuje 50 i více genů CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů G – pruhování normální mužský karyotyp 46,XY CHROMOZOMY V PRAXI pruhování chromozomů další typy pruhování • Q – pruhování - barvení akridinovými deriváty (fluoreskující látky – fluorochromy) – pruhy analogické jako u G - pruhování • R – pruhování – R = reverse (opačné pruhy ve srovnání s G - pruhy) – zahřátí před obarvením CHROMOZOMY V PRAXI hodnocení Chromozomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení 1250x za použití imersních objektivů. Ke třídění chromozomů a sestavení karyotypu lze využít počítačového programu. MEIÓZA • typ buněčného dělení, při kterém z diploidních zárodečných buněk (primárních oocytů a primárních spermatocytů) vznikají haploidní gamety (z 1 diploidní zárodečné buňky vzniknou 4 haploidní gamety) • základní schema průběhu meiózy – proces zahrnuje 2 meiotická dělení • meióza I – počet chromozomů je redukován z diploidního na haploidní, dochází k rekombinaci genetického materiálu – meiotický crossing-over • meióza II – podobnost s mitózou – rozchod sesterských chromatid PORUCHY V MEIÓZE • meiotická nondisjunkce – nejčastější mutační mechanismus našeho druhu, proces, při kterém se oba chromozomy v páru v anafázi meiotického dělení přemístí ke stejnému pólu místo aby segregovaly k opačným pólům - porucha oddělení páru chromozomů během jednoho ze dvou meiotických dělení (většinou v průběhu meiózy I) • důsledkem nondisjunkce je aneuploidie – abnormální počet chromozomů v karyotypu, který je způsoben absencí chromozomu nebo přítomností nadbytečného chromozomu Vrozené a získané chromozomové aberace CHROMOZOMOVÉ ABNORMALITY (ABERACE) • vrozené chromozomové aberace (VCA) (vyšetření karyotypu) - početní - strukturní - prenatální a postnatální stanovení karyotypu (vyšetření karyotypu plodu, vyšetření dětí s vrozenými vývojovými vadami, párů s poruchou fertility .…) • získané chromozomové aberace (ZCA) (stanovení % aberantních buněk) - vyšetření u pacientů, kteří pracují v rizikovém prostředí (kontakt se škodlivými látkami, zářením) …. VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromozomů • abnormality počtu chromozomů - polyploidie – počet chromozomů je více než dvojnásobkem haploidního počtu (n = 23) (triploidie 3n = 69, tetraploidie 4n = 92), většinou pouze u plodů (samovolné aborty) - aneuploidie – jev, kdy dochází k chybění nebo nadbytku chromozomů ve všech buňkách jedince nebo v jedné či více jeho buněčných liniích v důsledku chybného rozchodu chromozomů v meióze nejčastější a klinicky velmi významný typ chromozomových poruch VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromozomů aneuploidie • trizomie – nejčastější porucha (místo 2 chromozomů v páru přítomny 3) - trizomie autozomů (trizomie celého chromozomu je jen vzácně slučitelná se životem) - Downův syndrom 47,XX/XY, +21 - Edwardsův syndrom 47,XX/XY, +18 - Patauův syndrom 47,XX/XY, +13 - trizomie gonozomů (fenotypové důsledky jsou méně závažné než u trizomie autozomů) - Klinefelterův syndrom - další syndromy VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autozomů Downův syndrom Downův syndrom 47, XX, +21 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autozomů Edwardsův syndrom Edwardsův syndrom 47,XY,+18 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autozomů Patauův syndrom Patauův syndrom 47,XY,+13 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonozomů Klinefelterův syndrom Klinefelterův syndrom 47,XXY VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromozomů aneuploidie • monozomie – méně častá porucha (místo 2 chromozomů v páru přítomen 1) - monozomie X (Turnerův syndrom) častý výskyt - monozomie autozomů obvykle slučitelná se životem jen v mozaice (v těle jedince mohou být přítomny 2 nebo více buněčné linie s různou chromozomovou sestavou, např. linie normální s linií s monozomií chromozomu č.18) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonozomů Turnerův syndrom Turnerův syndrom 45,X VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • strukturní abnormality chromozomů • méně časté než aneuploidie • dochází k přestavbám a následně ke změnám morfologie chromozomů • předpokladem je vznik zlomů na chromozomech VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace • translokace – nejčastější ze strukturních aberací, předpokladem je vznik dvou zlomů, každý na jednom chromozomu balancované translokace – reciproká výměna chromozomových segmentů mezi dvěma, zpravidla nehomologními, chromozomy robertsonovské translokace – 2 akrocentrické chromozomy fúzují v oblasti centromery a ztrácejí svá krátká raménka (ztráta nemá vliv na fenotyp) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace balancovaná translokace t(1;15) výměna koncových úseků chromozomů VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace robertsonovská translokace der(13;14) (derivovaný chromozom) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace dítě s nebalancovaným karyotypem - postižené 46,XY,der(16)t(16;21)mat translokace u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet a s tím spjatých potratů nebo narození potomků s nebalancovaným karyotypem (parciální monozomie jednoho a parciální trizomie druhého chromozomu) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace • balancované přestavby - v sadě chromozomů je zachováno normální množství chromozomového materiálu - většinou nemají fenotypové vyjádření, v buňkách je přítomen veškerý chromozomový materiál, i když v odlišném uspořádání • nebalancované přestavby – část chromozomového materiálu v karyotypu chybí (parciální monozomie) a část přebývá (parciální trizomie) - většinou dochází k fenotypovým abnormalitám VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze • inverze – na jednom chromozomu vzniknou 2 zlomy, segment mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení do chromozomu paracentrická inverze – oba zlomy jsou na stejném raménku, úsek nezahrnuje centromeru pericentrická inverze – na každém raménku je jeden zlom, invertovaný úsek zahrnuje centromeru VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze pericentrická inverze inv(8) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze paracentrická inverze inv(1) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inverze jako varianty normy pericentrická inverze inv(9)(p11;q13) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece • delece – ztráta úseku chromozomu, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální monozomie) terminální delece –ztráta koncového úseku chromozomu intersticiální delece – ztráta segmentu, uloženého mezi centromerou a terminální částí VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece terminální delece del (5pter) syndrom Cri du chat (syndrom kočičího křiku) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece míra klinických příznaků závisí na rozsahu deletovaného segmentu a na počtu a funkci genů, které jsou v něm obsaženy VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby delece intersticiální delece na chromozomu 13 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce • inzerce – nereciproký typ translokace - segment z jednoho chromozomu se vyčlení a vloží do jiného chromozomu buď ve své původní orientaci nebo opačné - k jejich vzniku jsou potřeba 3 body zlomu, 2 na jednom chromozomu a 1 na druhém - jsou poměrně vzácné (1:80000) - hrozí vznik nebalancovaných gamet a narození abnormálních potomků VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby inzerce inzerce úseku chromozomu č. 14 do chromozomu č. 6 VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace • duplikace – nadbytečný chromozomový segment, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální trizomie) - bývají méně nebezpečné než delece duplikace segmentu dup(6) VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromozomů marker chromozomy – malé chromozomy (s centromerou), často v mozaice, obtížně identifikovatelné (mohou být vrozené nebo kultivačního původu) kruhové chromozomy (ring chromozomy) – na obou koncích chromozomu vzniknou zlomy, dojde ke ztrátě koncových úseků, zbytek chromozomu se spojí VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromozomů VROZENÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby neobvyklé typy chromozomů • dicentrické chromozomy - na dvou chromozomech dojde ke zlomu - vznikne dicentrický chromozom fúzí úseků s centromerou a acentrického fragmentu spojením úseků bez centromery ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) • vyšetření vlivu mutagenních faktorů prostředí na člověka – z periferní krve • zvýšené % aberantních buněk v organismu přispívá k rychlejšímu stárnutí organismu, vzniku degenerativních onemocnění, je možné maligní zvrhnutí; aberace mohou být přítomny nejen v somatických, ale i v pohlavních buňkách, zvyšuje se riziko narození postiženého dítěte. • hodnotí se 100 buněk, za patologii je považován nález opakovaně 5% nebo více než 5% aberantních buněk ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku působení: • fyzikálních faktorů (ionizující záření) • chemických látek (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, alkylační činidla ad. látky používané v průmyslu) • biologických faktorů (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, zarděnky ad.) poškození chromozomů závisí na: • typu působících faktorů • fázi buněčného cyklu, ve které se nachází buňka v době působení mutagenu • dávce mutagenu ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) • gapy (mezery) – jednochromatidové, dvouchromatidové (G´), (G´´) - příčně slabě se barvící část chromatid, také úplné přerušení chromatid nepřesahující její šířku ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) • zlomy – jednochromatidové, dvouchromatidové - (Z´), (Z´´) - oddělení samostatného fragmentu (F) nebo párových fragmentů (DF) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) • výměny (V)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromozomů ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) • acentrické ringy, kruhové chromozomy- uzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromozomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromozomy zahrnují centromeru ZÍSKANÉ CHROMOZOMOVÉ ABERACE (ZCA) • chromozomy zahrnující více než 1 centromeru- dicentrické, tricentrické chromozomy… Metody molekulární cytogenetiky, příklady využití v klinické cytogenetice METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • molekulární cytogenetika aplikuje metody molekulární biologie na cytogenetické úrovni, vizualizuje a lokalizuje genetický materiál v buňkách • pracuje s metafázními chromozomy nebo interfázními jádry • potvrzuje a upřesňuje nálezy klasické cytogenetiky (translokací, delecí, inzercí, duplikací…) • řeší problémy klasické cytogenetiky – záchyt velmi malých chromozomových změn (jsou pod rozlišovací schopností (citlivostí) metod klasické cytogenetiky – např. mikrodelece, translokace velmi malých úseků chromozomů) - analýza složitých chromozomových přestaveb - identifikace nebalancovaného materiálu neznámého původu - analýza buněk v interfázi (chromatin není spiralizován do podoby chromozomů, je rozprostřen v celém objemu buněčného jádra) – zrychluje analýzu (bez kultivace) – výsledek do 24 hodin, řeší problémy klasické cytogenetiky – nedostatečný počet mitóz na sklíčku, špatná kvalita chromozomů • začátek rozvoje – přelom 60.- 70. let 20. století METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • využití: - analýza chromozomů z periferní krve – pouze VCA, ZCA se při rutinní analýze nevyšetřují molekulárně cytogeneticky! - analýza chromozomů z ostatních materiálů (plodová voda, krev plodu, kostní dřeň, solidní tumory….) • molekulárně cytogenetickými technikami nelze nahradit klasické karyotypování (před použitím metod molekulární cytogenetiky je třeba vědět, co chceme hledat – vysoká cena molekulárně cytogenetických metod, některé změny lze zjistit pouze klasickým karyotypováním) • oblasti uplatnění FISH – klinická cytogenetika (postnatální vyšetření u sterilních párů, postižených dětí a dospělých s podezřením na genetickou příčinu, genetická analýza pro účely umělého oplodnění, prenatální diagnostika karyotypu plodu) - nádorová cytogenetika - výzkum (evoluční studie karyotypu, mapování genomu ...) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – ISH (in situ hybridizace) - FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • technika, která se využívá k detekci a lokalizaci specifické DNA sekvence na chromozomech (cílová sekvence nukleotidů na metafázních chromozomech nebo interfázních jádrech) • SONDA (PRÓBA) – uměle nasyntetizovaná sekvence, úsek DNA dlouhý několik set bazí, komplementární k cílové sekvenci na chromozomu (v chromatinu) - sonda je značená – radioaktivně - fluorescenčně (fluorochromy) - FISH - enzymem METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • denaturace sondy a cílové sekvence (působení zvýšené teploty) – získání jednořetězcového vlákna DNA (je schopno vytvořit novou vazbu cílová DNA – DNA sonda, před denaturací vazba na komplementární řetězec DNA) – týká se sondy i cílové DNA • hybridizace sondy na cílovou DNA (chromozomy nebo interfázní jádra na podložním sklíčku) – dochází ke specifické vazbě sondy na cílové místo (chromozom, gen) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • vyhodnocení a zpracování signálu – FISH - fluorescenční mikroskop napojený na počítač – vizualizace a kvantifikace (signál září v tmavém poli) – modrá barvička (DAPI) obarvuje všechny chromozomy, červený signál = fluorescenčně značená sonda METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – typy sond • celogenomové sondy – směs úseků DNA, které se vážou na všechny chromozomy (CGH) – všechny úseky DNA naznačeny jedním fluorochromem • celochromozomové (malovací) sondy – směs mnoha sond specifických pro sekvence konkrétního chromozomu, které označí chromozomy po celé délce • centromerické sondy – vazba na centromeru • telomerické sondy – vazba na telomery • lokus specifické sondy (sondy pro jedinečné sekvence) – vazba na specifickou oblast chromozomu – gen, část genu METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – využití sond • využití celochromozomových sond – potvrzení translokací mezi nehomologními chromozomy METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – využití sond • využití celochromozomových sond (a telomerických) – detekce složitějších přestaveb METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – využití sond • využití centromerických sond – určení počtu chromozomů v chromozomovém páru (diploidie, aneuploidie) v metafázi a interfázi METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – využití sond • využití telomerických sond – detekce delecí, translokací METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – využití sond • využití lokus specifických sond – detekce delecí částí genů (DMD – Duchenova muskulární dystrofie), onkologie – detekce fúzních genů (fúzní gen BCR/ABL) – kombinace lokus specifických sond METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – využití sond • využití lokus specifických sond - detekce mikrodelece na chromozomu 22 u Di Georgeova syndromu (mikrodeleční syndrom) (kombinace lokus specifických sond) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) – využití sond – mikrodeleční syndromy PWS-AS • využití lokus specifických sond - detekce mikrodelece na chromozomu 15 u mikrodelečních syndromů Prader-Willy (PWS) a Angelman (AS) (oblast na chromozomu, asi 100 genů) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) zeleně označeny úseky na chromozomech, které jsou v karyotypu maligního klonu zmnoženy, červeně označeny chybějící úseky chromozomů (obrázky převzaty z internetu) METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) • modifikace metody CGH : - HR–CGH (high resolution CGH) – CGH s vysokým rozlišením, odhalí chybění či nadbytek menších úseků DNA než CGH, metodika se od CGH liší počítačovým zpracováním – rozlišovací schopnost metody přibližně 4 Mb - ARRAY-CGH – na microarraye (skleněné mikroskopické destičky) jsou navázány úseky DNA, jejichž delece či amplifikace nás u konkrétního pacienta zajímá (destičky s DNA sekvencemi (mikročipy) lze zakoupit), připravíme celogenomové sondy stejným způsobem jako u CGH, nahybridizujeme na destičku, analyzační software měří intenzity fluorescence v jednotlivých bodech na destičce (v místech vazby konkrétních sekvencí) - význam ARRAY-CGH – mapování s vyšším rozlišením než HR-CGH , rozlišovací schopnost závisí na množství DNA, které se nachází v jednotlivých bodech na destičce (kratší – delší sekvence) – až 35 kb METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) • 1996 • umožňuje vizualizaci všech lidských metafázních chromozomů při jednorázové hybridizaci – 5 fluorochromy značená směs chromozomově specifických sond, jedinečná kombinace sond na každém chromozomu, každý chromozomový pár má jinou barvu • SKY a M-FISH se liší jen systémem filtrů, který se používá při vizualizaci chromozomů fluorescenčním mikroskopem (SKY – 1 filtr, M- FISH – 5 filtrů, zvlášť pro každý fluorochrom) – mikroskop je napojen na kameru a počítač – snímání a zpracování obrazu • význam – vyjasnění složitých přestavech (komplexních aberací) - identifikace kryptických (skrytých) přestaveb - identifikace původu markerů a ring chromozomů – obtížně určitelné klasickými metodami i samostatnými sondami • limity – nelze detekovat nebalancovaný materiál (nadbytek-chybění DNA) inverze METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) SKY – mitóza po hybridizaci se směsí fluorochromů METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – m-BAND (mnohobarevné pruhování) • 1999 • mnohobarevná pruhovací technika s vysokým rozlišením, pomocí které lze analyzovat intrachromozomální přestavby (inverze, inzerce, delece) a mapovat místa zlomů na chromozomech Nádorová cytogenetika ONKOCYTOGENETIKA základy • zhoubné bujení je genetické onemocnění • vznik nádoru (maligní transformace) je mnohastupňový proces – sled genetických změn – mutace genů řídících buněčné dělení, růst a diferenciaci, buněčný zánik, reparaci DNA, přestavby na úrovni chromozomů a genomu, narušení integrity genomu (defekty v genech zajišťujících chromozomovou stabilitu a přesnou mitotickou segregaci) • mutace mohou vzniknout de novo před vznikem nebo během vývoje nádoru, některé je možné zdědit jako familiární predispozici k nádorovému onemocnění • nádorová buňka je charakterizována trvalým a nekoordinovaným dělením, vymkla se signálům, které řídí její funkci • maligní buňky mají během vývoje nádoru tendenci akumulovat chromozomové abnormality = získané chromozomové změny v důsledku poruchy regulačních mechanizmů buňky (srovnej s kapitolou ZCA – vznik přestaveb v důsledku působení faktorů vnějšího prostředí). Je třeba je odlišovat od konstitučních, vrozených chromozomových změn (viz VCA). ONKOCYTOGENETIKA základy • klon – skupina geneticky identických buněk (maligní sublinie) • chromozomové změny - konstantní změny – jsou nenáhodné, hrají roli při vzniku malignity - aberace náhodné – průvodní jev při progresi nádoru - primární – aberace, jimiž jsou ovlivněny geny, jejichž změna může vést přímo k transformaci postižené buňky v buňku nádorovou - sekundární (většina) – vznikly během vývoje maligního onemocnění • komplexní chromozomové změny – charakteristický znak zhoubných nádorů zvláště v pozdějších stádiích progrese nádoru - hromadění nových strukturních a numerických změn chromozomů • konkrétní chromozomové změny mohou být spojeny s dobrou, středně dobrou nebo špatnou prognózou vývoje onemocnění ONKOCYTOGENETIKA základy – komplexní karyotyp ONKOCYTOGENETIKA protoonkogeny - onkogeny • protoonkogeny – normální geny přítomné ve všech buňkách, jsou zahrnuty do procesů regulace buněčné proliferace (buněčného dělení, růstu a diferenciace) a reparace (opravy) DNA • onkogeny – mutované („aktivované“) alely protoonkogenů, mutace vede k zisku funkce nebo změně funkce (atypická aktivace). Usnadňují maligní transformaci. ONKOCYTOGENETIKA protoonkogeny - onkogeny • typy aktivace – inzerce - bodové mutace (mutace genu samotného nebo jeho regulačních oblastí) - chromozomové translokace (poziční efekt – protoonkogen se přesune pod vliv silného promotoru, začne se silněji exprimovat, fúzní protein má nádorové vlastnosti) – t(9;22) BCR/ABL, t(15;17) PML/RARA - genové amplifikace (zvýšení počtu kopií genu v genomu – u pokročilejších tumorů) - amplifikace onkogenu N-myc na chromozomu 2p u neuroblastomu • účinek onkogenů je dominantní – stačí 1 mutovaná alela genů k přeměně fenotypu buňky z normální na rakovinnou (transformace) • k transformaci buňky je třeba nahromadění většího počtu genetických změn – nestačí aktivace 1 onkogenu • příklady onkogenů – MYC, ABL ONKOCYTOGENETIKA tumor supresorové geny • tumor supresorové geny (antionkogeny) – normální buněčné geny, jejichž funkcí je zabraňovat nekontrolovanému dělení buněk. Řídí buněčné dělení a diferenciaci, zabraňují tvorbě metastáz regulací buněčného cyklu, kontaktní inhibicí růstu buněk, reparací DNA. Jejich onkogenicita se projeví při ztrátě funkce (inaktivaci) obou alel genu. • účinek tumor supresorových genů je recesivní – k iniciaci nádorového procesu musí být inaktivovány obě alely genu nacházející se na homologních chromozomech • mutační mechanizmy – mutace vedoucí k inaktivaci obou alel genu - ztráta (delece) celého genu (1 delece může být zděděná, druhá získaná) - ztráta části chromozomu - ztráta celého chromozomu • příklady tumor supresorových genů – gen RB1 chr. 13, gen WT1 chr. 11 ONKOCYTOGENETIKA hodnocení preparátů • metodami klasické cytogenetiky – G pruhování chromozomů, stanovení karyotypu maligních klonů (světelný mikroskop, počítačový dokumentační systém) ONKOCYTOGENETIKA hodnocení preparátů • metodami molekulární cytogenetiky (FISH) – v interfázi nebo metafázi ONKOCYTOGENETIKA hodnocení preparátů • metodami molekulární cytogenetiky (SKY) – ukáže mnohem větší rozsah abnormalit než je viditelný pruhovacími metodami ONKOCYTOGENETIKA hodnocení preparátů • metodami molekulární cytogenetiky (CGH) ONKOCYTOGENETIKA typy chromozomových změn • chromozomové změny - početní – aneuploidie – jev, kdy dochází k chybění nebo nadbytku chromozomů v buňce (nondisjunkce) - aneuzomie – hypoploidie (hypohaploidie – počet chromozomů menší než haploidní (23), hypodiploidie – počet chr. je menší než diploidní (46) , hypotriploidie - ….menší než triploidní (69), hypotetraploidie - ….menší než tetraploidní (92) atd.) – (multipolární mitózy, aneuploidie) - hyperploidie (hyperhaploidie – počet chromozomů větší než haploidní, hyperdiploidie - ….větší než triploidní atd.) - (endomitóza) Vznikají v důsledku poruch mitózy – nondisjunkce (chybný rozchod chromozomů) v mitóze, endomitóza (v S fázi buněčného cyklu dojde k replikaci DNA, ale chromozomy se v mitóze nerozcházejí, jádro se nedělí, tzn. počet chromozomů je zdvojený (nebo znásobený, pokud proces proběhl vícekrát)), multipolární mitózy (abnormální redukce počtu chromozomů). ONKOCYTOGENETIKA typy chromozomových změn – aneuploidie ONKOCYTOGENETIKA typy chromozomových změn – aneuzomie abnormální počet chromozomů v karyotypu maligního klonu ONKOCYTOGENETIKA typy chromozomových změn • chromozomové změny - strukturní změny, které lze nalézt klasickým karyotypováním: – translokace – balancované (výměny chromozomových segmentů mezi dvěma, zpravidla nehomologními, chromozomy, v karyotypu je zachováno normální množství chromozomového materiálu) - nebalancované (část chromozomu chybí (parciální monozomie), část přebývá (parciální trizomie, tetrazomie, atd.) - inverze - na jednom chromozomu vzniknou 2 zlomy, segment mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení do chromozomu - delece - ztráta úseku chromozomu, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální monozomie), terminální nebo intersticiální - amplifikace - v buňce je přítomno mnoho kopií nějakého segmentu genomu - izochromozomy, ring chromozomy, marker chromozomy metodami molekulární cytogenetiky potvrzujeme nálezy klasické cytogenetiky a nalézáme další přestavby, které nejsou viditelné na chromozomech s G-pruhy: inzerce, translokace, delece malých úseků, odhalí původ marker chromozomů, ring chromozomů ….. ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - translokace • t(9;22) – reciproká translokace ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - translokace • t(9;22) je specifickým markerem CML (chronická myeloidní leukemie) - Ph chromozom, obsahuje fúzní (chimérický, hybridní) gen BCR/ABL Na chromozomu 9 se v oblasti, kde dochází ke zlomům, nachází gen ABL, na chromozomu 22 gen BCR. Při translokaci dochází k výměně částí genů, vznikají fúzní geny BCR/ABL a ABL/BCR. Proteiny, které vznikají expresí těchto genů, získávají nové funkční vlastnosti oproti původním genům BCR a ABL. Z hlediska onkocytogenetiky má význam gen BCR/ABL, který podmiňuje vznik CML. ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - translokace • FISH detekujeme přestavbu BCR/ABL, lokus specifická sonda umožňuje vyšetřovat i interfázní jádra – vznik fúzního signálu u fúzního genu (změna barvy signálu - žlutá, samostatné signály zelená a červená) ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - translokace • další časté translokace: - t(8;21) – fúzní gen AML1/ETO AML-M2 (akutní myeloidní leukemie podtyp M2) - t(15;17) – fúzní gen PML/RARA AML-M3 - translokace s chromozomem 8, místo zlomu v protoonkogenu c-MYC lymfomy ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - translokace potvrzení translokace u onkologických pacientů pomocí celochromozomových sond na metafázních chromozomech ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - inverze • inv(16) – AML-M4 Eo ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - delece • jsou spojeny se ztrátou částí chromozomů většího nebo menšího rozsahu • nacházíme je především u solidních nádorů, ale i u hematologických malignit • delece u solidních nádorů - delece tumor supresorového genu RB1 chr. 13q – retinoblastom (nádor sítnice) - delece protoonkogenu WT1 chr. 11p – Wilmsův tumor (nádor ledvin) • delece u leukemií delece 5q až úplná ztráta chromozomu 5 (různý rozsah delece) delece 11q často v oblasti genu MLL ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - amplifikace • genová amplifikace – v buňce je přítomno mnoho kopií nějakého segmentu genomu - homogenně se barvící oblasti (HSR) - několik tisíc genových kopií - amplifikace onkogenu n-MYC u neuroblastomu (zelený signál – centromerická sonda, červený signál – lokus specifická sonda) – analýza v interfázním járře – amplifikovaný materiál z jednoho chromozomu rozložen po celém jádře, chromozom despiralizován - amplifikace genu MLL u leukemií (lokus specifická sonda) – analýza na metafázních chromozomech – lokalizace HSR na chromozomu v místě lokalizace genu ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - amplifikace • genová amplifikace - double minutes (DM) = velmi malé nadbytečné chromozomy – vznik rozpadem HSR - homogeneously stained regions (nalézáme je v mitóze – chromozomový materiál rozlámaný na malé kousky) ONKOCYTOGENETIKA příklady typických chromozomových změn - izochromozom izochromozom 17q u dětského tumoru (červený signál – telomerická sonda na oblast 17q) VÝZNAM ONKOCYTOGENETICKÉHO VYŠETŘENÍ • zpřesnění diagnózy • stanovení prognózy onemocnění • zjištění fáze onemocnění (remise, relaps) • sledování úspěšnosti léčby (transplantace kostní dřeně při léčbě leukemií, chemoterapie) • charakteristika dosud nepopsaných chromozomových abnormalit TYPY NÁDORŮ VYŠETŘOVANÉ CYTOGENETICKY na OLG FN Brno • HEMATOLOGICKÉ MALIGNITY (leukemie) - lymfoblastická leukemie – postihuje buňky lymfoidní vývojové řady – akutní (ALL) – nejčastější u dětí - chronická (CLL) - myeloidní leukemie – postihuje buňky myeloidní vývojové řady – akutní (AML) – t(15;17), t(8;21), inv(16) - chronická (CML) – t(9;22) - Ph chromozom - myelodysplastický syndrom (MDS) – dysplastické změny v hemopoetických řadách v kostní dřeni – del(5) • SOLIDNÍ NÁDORY - všechny typy maligních nádorů u dětí – nádory CNS, Ewingův sarkom, Wilmsův tumor, osteosarkomy, lymfomy a další …… Preimplantační genetická diagnostika PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA (PGD) • časná prenatální diagnostiku, která je vázaná na techniky umělého oplodnění. • genetické vyšetření jedné nebo dvou buněk (blastomer) odebraných z vyvíjejícího se vícebuněčného embrya (stáří 2-3 dny), lze odhalit genetické abnormality budoucího plodu • k transferu do dělohy lze vybrat pouze embrya bez genetické zátěže • cílem je zvýšit úspěšnost metod asistované reprodukce a snížit riziko spontánních potratů PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA (PGD) PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA (PGD) PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA (PGD) PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA (PGD) PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA (PGD) PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA (PGD) Omezení a rizika metody • limitovaný počet buněk dostupných genetické analýze • možné riziko narušení vývoje vyšetřovaného embrya • není vyloučená jiná genetická vada • doplnění PGD amniocentézou Doporučená literatura • Klinická genetika, Thompson 2001 • Základy klinickej genetiky, Sršeň, Sršňová 1995, 2005 • Základy lékařské genetiky, Pritchard, Korf 2003 kontakt konzultace: mhanakova@fnbrno.cz Děkuji za pozornost