iVť'llflŕ'!
:


B
r f.-11,-?.
ífkĚbMt

m
ÉÉí
■■ ■■:-.:--. m
■   A     p s • • :■-";; /• -i . * í t fjj \iJľ -Vi
!>#

*:*:íl
íl
\®



.=■■/.■
,,. ....

;■;..-:
		Sswwl
	i	■SSS»«Í
xg^T-v		HjWMH
/   In		■ww«
B		»sw«9
V		»sw«i
		■»«wi
		■ttWttí
^^^		■sss«s^
J^fc*.		»swtti
/   Bi		■iw««3
1    B?		■sss«s^
^1 w		■SSWttl
^^		■sswtti
		■íw««3
O	1____! 8	
^r^	V	05      M
||	o Q	
	■q	•c   .2
W	*	Q.    "O
		
stěna cévy
.bílé krvinky
wi
červene , krvinky
:.:ŕ
destička
LEUKOCYTY
KREVNÍ DESTIČKY

miílii'.ľl'.í í   ; !i!i!!lli::ill[ |lÍ!i!!ii!l!i!  Í4!>!;i!!iií!! r
liiiiiMiiii: i jr«(S!i!Hi u iííě if ls^íi:ií^iiírLi"?]íiiS!i]i:«!i]i:«
íi3iiiřiiariiMf3ii#iiiiii -MBiif"
í
míš&
:: = «
«p*
BB IBI aa) aa •>
BB IBI Bil ■■! »
í í jjií pii 55 >' SS !■» a»l P" ■
:í ws «i« í
■! IS! í! Í! í J! Ir
iií
Lymfocyt
'
IZOLACE DNA Z JEJICH JADER
Basofil
XY    Neutrofil
Eosinofil
Monocyt
Vysrážená DNA
Vysrážená DNA

i
■ä*,.
-
i*v:
k
í
I

í \ 1     l	Ti
Měření koncentrace DNA na spektrofotometru
Měření koncentrace a kvalitv DNA na aelu
Polymerazova řetězová reakce
PCR (Polymerase Chain Reaction)
•   1983 NC-Kary MuIIis
•   molekulárně biologická metoda umožňující amplifikaci specifické sekvence DNA in vitro založená na principu replikace
•   umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování
REAKČNÍ SLOŽKY:
•   DNA (RNA) 50ng-1 Mg
•   PRIMERY- syntetické oligoN o délce 18-30 N
•   TERMOSTABILNÍ POLYMERÁZA {Taq, Tth, Tma, Pfu,Pwo)
•   dNTPs
•   Mg2+, pufr, BSA, ...
Termocykler- teplota se mění automaticky v naprogramovaných časových intervalech.
Reakční podmínky: 1. Počáteční denaturace 95 °C, 2-5 min
2. DENATURACE DNA: 94- 95 °C, 20-45s:
3. PŘIPOJENI PRIMERU: ~ 55-65 °C, 30-9OJ5 Ta = Tm-5 °C = 2 (A+T) + 4 (G+C) - 5 °C  \     '    X
4. POLYMERACE: 72 °C, 45-90s
5. Závěrečná extenze- 72 °C , 5 min, dokončení syntézy a renaturace
Teoretický výtěžek 2n; n-počet cyklů
PRŮKAZ AMPLIFIKOVANEHO PCR
PRODUKTU
Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou ELFO (agarózová , PAGE)- sekvence, délka
Štěpení produktu restrikčními enzymy a posouzení spektra restrikčních fragmentů
Detekce produktu hybridizací se značenou
sondou
(po ELFO, in situ) - Southern blotting
Využití metody PCR
Základní výzkum
- izolace genů nebo jejich částí
- sekvenování DNA
- analýza (selekce) klonů z genových knihoven
- příprava značených sond
Aplikovaný genetický výzkum
- prenatální diagnostika (dědičných chorob)
- detekce mutací v genech
- studium polymorfizmu
- populační genetika
Využití v klinických disciplínách
-  detekce mutací v genech asociovaných s monogenně dědičnými chorobami
-  detekce patogenu (bakterie, viry, prvoci, houby)
-  identifikace onkogenů
- typizace nádorů
-  stanovení pohlaví,...
Využití v praxi
-  archeologie
-  soudnictví (paternitní testy)
-   kriminalistika,...
Modifikace PCR
Zpětná (reverzní) PCR (RT-PCR)- amphfikace molekul RNA. RNA se nejdříve přepíše zpětnou trankriptázou do cDNA, která se pak amplifikuje standardním způsobem.
In situ PCR- amphfikace specif, sekvencí NK v buňkách v cytologických preparátech tkání nebo chromozómů.
Multiplex PCR- amphfikace několika specifických sekvencí najednou pomocí dvojic primem.
Inverzní l-PCR- amphfikace úseků DNA o neznámé sekvenci ohraničené na obou stranách DNA se známou sekvencí.
Princip reverzní transkripce
RNA	'		hWFEEWfl
cDNA	Tíh, MM		b^^BHKi^mm3
			
	Ja^-polymeráza     i		specifický primer
Odstranění RNA RNázouH
Kvantitativní PCR
(real-time PCR, online PCR, kinetic PCR, quantitative
PCR; Q-PCR) Higuchietal., 1992
varianta, umožňující přímou kvantifikaci PCR produktu v reálném čase
amplifikace lze sledovat a kontrolovat průběžně se standardem (housekeeping gene)
stanovení koncentrace v rozsahu několika řádů
přesnost a reprodukovatelnost
uzavřený systém, redukce chyb
lze poměrně snadno optimalizovat
LightCycIer, fa ROCHE