Etanol Etanol n Etanol je obsažen v alkoholických nápojích: whisky, slivovice apod. obsahují 30 – 60 %, vína 6 – 12 % a pivo 2 – 5 % etanolu V klinické praxi se vyskytují: n Projevy chronického zneužívání (alkoholické léčebny, psychiatrie) n Akutní otravy způsobené záměrným nebo i náhodným požitím velkého množství etanolu, často v kombinaci s požitím různých léků a drog Klinická oddělení potřebují rychle n potvrdit či vyloučit otravu alkoholem n zvolit odpovídající terapii K tomu nejčastěji slouží enzymatické stanovení etanolu Etanol n Po požití se etanol rychle vstřebává již v žaludku ( rychleji na lačno) n Rychle proniká prakticky všemi membránami včetně placenty n Poměrně rychle se v organismu metabolizuje: nejdříve působením alkohol - dehydrogenázy vznikne acetaldehyd Etanol + NAD^+ <----à Acetaldehyd + NADH + H^+ Acetaldehyd se působením aldehyd-dehydrogenázy mění na acetyl-CoA Acetaldehyd + NAD^+^ <----à Acetyl-CoA + NADH + H^+ Konečným produktem metabolizace je kyselina octová (respektive CO[2] a voda) n Rychlost eliminace etanolu z organismu je u konkrétního jedince prakticky konstantní ( u mužů asi 100 mg etanolu na kg tělesné hmotnosti za hodinu, u žen jen asi 85 mg/kg/hod ) n Metabolizace bývá ukončena během 6 – 8 hodin n Asi 5 % požitého etanolu se vylučuje z organismu v nezmetabolizované formě močí, potem apod. Etanol Klinické údaje: n Etanol se vstřebává v gastrointestinálním traktu a dostává se do krve n 0,6-0,8 ‰(g/l ) - počínající opilost n 1-2 ‰ opilost n Přes 2 ‰ těžkou intoxikaci n Smrtelná dávka je 6-8 g/kg tělesné hmotnosti ( tedy u dospělého asi 300-500 g etanolu) n Při chronickém používání vznikají nemoci jaterní, poškození ledvin a nemoci nervové n Etanol zvyšuje citlivost organismu na otravy některými látkami (tetrachlormetan, anilin, olovo, rtuť); interakce s řadou léků Etanol Klinické údaje: n Koncentrační časový profil v krvi, dechu i slinách je prakticky stejný n Pomocným kriteriem při stanovení etanolu je srovnání naměřené osmolality séra a vypočtené osmolality (2x Na + glukoza + urea) - Osmolární gap 23 mmol/kg odpovídá cca 1 ‰ etanolu n Referenční rozmezí: 0 mmol/l , 0 g/kg neboli promile (o/oo) n Poznámka: Přepočet výsledku - mmol/l / 22,32 = o/oo Etanol Odběr materiálu: n Odběr pro stanovení etanolu - do běžných odběrových zkumavek (sérum, plasma) n Nabrat plnou zkumavku n Zabránit použití desinfekčních prostředků obsahujících alkohol n Vzorky ihned po odběru dobře uzavřít (pokud se stanovení neprovádí bezprostředně, uchovávat při 2 – 8 °C) n Stanovení etanolu v krvi, séru a plasmě: Enzymaticky: n Enzymatický test prováděný na automatických analyzátorech je založen na oxidaci alkoholu s NAD^+ na acetaldehyd za katalýzy alkoholdehydrogenasy ( ADH). ADH C[2]H[5]OH + NAD^+ <---à CH[3]CHO+ NADH + H^+ ^ n Vznikající NADH je přímo úměrný obsahu alkoholu ve vzorku a fotometricky se stanovuje při 340 nm n Metoda je specifická pro etanol i v přítomnosti acetaldehydu, acetonu, butanolu, etylenglykolu, izopropanolu, metanolu a propanolu v koncentracích do 20 g/l n Stanovení není určeno pro soudně lékařské a forenzní účely Stanovení etanolu v krvi, séru a plasmě: Headspace plynová chromatografie n Krev je zahřívána ve speciální uzavřené lahvičce n Zahřátím se etanol uvolní z krve do vzduchového prostoru v lahvičce ( headspace ) n Určitá část z tohoto prostoru je automaticky injektována do plynového chromatografu n Před analýzou jsou vzorky krve nebo séra naředěny roztokem chloridu sodného s obsahem n-propanolu jako vnitřního standardu. Chlorid sodný zvyšuje tlak par etanolu a eliminuje rozdíly v matrici n Plynová chromatografie je jediná metoda použitelná pro forenzní (soudní) účely Stanovení etanolu Dechová zkouška– screeningový test n Časté použití vzhledem k nebezpečnosti a protizákonnosti či limitaci požití alkoholu při řízení motorových vozidel a v zaměstnání n Princip: IČ absorpční spektroskopie ( nejčastěji) Fotometrie - etanol se při oxidačně – redukční reakci s bichromanem v prostředí kyseliny sírové oxiduje na kyselinu octovou Elektrochemická oxidace n Mezi alkoholem v krvi a v dechu je ustavena rovnováha přibližně 2100:1 (krev : dech) Stanovení etanolu Ve slinách n Snadný a neinvazivní sběr n Sliny absorbovány do vatového tamponu, ten vložen do testovací kartridže n Reakce založena na reakci s ADH s vizuální end point detekcí (2 min inkubace) n Koncentrace odpovídá sérovým hodnotám V moči n Koncentrace alkoholu je přibližně 1,3x vyšší než v krvi - může být variabilní, omezený význam stanovení n Při stanovení etanolu v moči vadí obsah cukrů v moči, který může způsobit pozitivní interferenci v důsledku metabolizace cukrů na etanol Laktát n Laktát (sůl kyseliny mléčné) vzniká především v kosterním svalstvu, mozku, kůži a erytrocytech n Přibližně 65% laktátu je zpracováno v játrech n Větší množství laktátu vzniká při dlouhodobé intenzivní fyzické aktivitě n Laktát je konečným produktem glykolýzy za anaeorobních podmínek n Signifikantní laktátovou acidózu představuje koncentrace laktátu větší než 5 mmol/l a pH menší než 7,25 n Pot obsahuje značné množství laktátu - zabránit dotykání se špiček n Referenční rozmezí P- laktát : 0,6 - 2,3 mmol/l CSF-laktát : 1,2 - 2,1 mmol/l Laktát Stanovení v plasmě a likvoru Preanalytické požadavky: n K odběru pro stanovení v plasmě se využívají zkumavky s fluorid/EDTA nebo fluorid/oxalátem n Vzorek je nutné stočit co nejdříve, nejpozději do 2 hod po odběru Stanovení laktátu s laktátdehydrogenasou: n LD L - laktát + NAD^+ <-------------à pyruvát + NADH + H^+ (pH 9-9,6) n n ALT n pyruvát + L - glutamát <-------------à- L-alanin + oxoglutarát n Reakce laktát - pyruvát běžně běží výrazně vlevo n Při pH 9 - 9,6 a následné reakci, kdy je spotřebováván pyruvát se rovnováha posunuje vpravo n Fotometricky se měří nárůst absorbance NADH při 340 nm Stanovení laktátu s laktátoxidasou: n Laktát je v přítomnosti specifického enzymu laktátoxidasy oxidován na pyruvát: LOD L - laktát + O[2] < ------------------- > pyruvát + H[2]O[2 ] n Peroxid vodíku dále reaguje oxidační kopulací např. s 4-aminofenazonem a 1,7 – dihydroxynaftalenem v přítomnosti peroxidasy (POD) za vzniku barviva - absorbance je přímo úměrná koncentraci laktátu POD 2 H [2]O[2] + 1, 7 – dihydroxynaftalen + 4-aminoantipyrin^+ < ------- > barvivo + 4H[2]O Stanovení laktátu v hemolyzátu či plasmě n Elektrochemicky na POCT či glukometrech s využitím biosenzoru n S využitím kapilárního odběru n V senzoru je zabudován enzym LOD, který katalyzuje vznik peroxidu vodíku L - laktát + O[2] < ----- > pyruvát + H[2]O[2 ] n Peroxid vodíku se rozkládá na platinové elektrodě za uvolnění elektronů – generovaný proud se stanoví amperometricky