Automatické imunochemické analyzátory • Automatizace koncem 80. let • Uplatnění pro analyty s nízkou koncentrací (nmol/l, pmol/l) • Využití reakce antigen – protilátka • Značená protilátka (případně antigen) • Většinou heterogenní imunoanalýza (pevný povrch – paramagnetické částice, kulička) • Doba analýzy 15 – 60 min • Detekce s vysokou citlivostí (chemiluminiscence, elektrochemiluminiscence, fluorescence..) Automatické imunochemické analyzátory Základní postup: • smíchání komponent • inkubace – vznik kompexu antigen - protilátka • separace (v případě heterogenní imunoanalýzy, časté využití magnetu) • reakce značenky komplexu antigen – protilátka s chemickou látkou startující reakci s detekovatelným efektem • detekce (př. chemiluminiscence) Automatické imunochemické analyzátory • Jsou opatřeny čtečkou čárového kódu, umožňují tak jednoznačnou identifikace pacienta • Zpracovávají vzorky v primární zkumavce , práce po pacientech - Random Access • Požadavky pro jednotlivé analýzy jsou přijímány z laboratorního informačního systému (LIS), analýza pak probíhá automaticky bez zásahu obsluhy • Jedná se o uzavřené systémy – pouze pro reagencie výrobce přístroje Automatické imunochemické analyzátory • Kazetový systém reagencií • Detekce sraženiny patří ke standardní výbavě • Cena imunochemických vyšetření poměrně vysoká - řádově mezi 50 – 200 Kč • Principy jednotlivých firem se liší typem značenky, separace a detekce Advia Centaur (Bayer) • Pracuje s diagnostickými soupravami firmy BAYER Diagnostics • Analyzovaným materiálem je sérum/plasma nebo moč. • Pracuje po pacientech při využití principu "RANDOM ACCESS„ - analýzy se provádějí v optimálním časovém rytmu • Stroj se nemusí zastavovat pro doplnění reagencií a vzorků Advia Centaur (Bayer) ADVIA Centaur je plně automatizovaný chemiluminiscenční analyzátor pro rutinní i statimová vyšetření. Výkon: 240 stanovení za hodinu, první výsledek je po 15 minutách, dále každých 15 sekund Princip měření: Systém měří kvantitativní množství světla emitovaného během chemiluminiscenční reakce, pevná fáze jsou paramagnetické částice (Fe[2]O[3]), magnetická separace, značkovač je AE (acridinium ester), což je chemiluminiscenční látka, která emituje světlo při oxidaci H[2]O[2]v alkalickém prostředí. Reakce probíhá během jedné sekundy a je velice citlivá ( 10^-15 ). Advia Centaur (Bayer) Metody: Thyroidní hormony: FT4, TT4,FT3, TT3, TSH, TU, TSH-3, neonatal TSH, Anti - TPO Reproduktivní hormony: Prolactin, FSH, Progesteron, hCG, Estradiol, Testosteron, LH Anemie: B12, Foláty, RBC Foláty, Ferritin Tumor markery: AFP, CEA, PSA, komplex PSA, CA 15-3, /B27.29/, CA 125, CA 19-9, TDM: Digitoxin, Carbamazepin, Phenobarbital, Tobramycin, Digoxin, Genamicin Kardio markery: CKMB, cTroponin I, Myoglobin Alergie: total IgE Ostatní: Kortizol Infekce: Rubella G, Rubella M, Toxoplasma G, Toxoplasma M Advia Centaur (Bayer) • Reagencie: Kazetový chlazený zásobník s 30 pozicemi - jsou neustále promíchávány. Automatická kontrola hladiny reagencie • Vzorky: Lineární podavač s kontinuálním přístupem totéž pro kontroly, standardy • Kyvety: akrylové, na jedno použití • Kalibrace: Kalibrační křivka se vkládá do analyzátoru pomocí čtečky čárového kódu načtením. Master křivky z příslušného setu. Advia Centaur (Bayer) Centaur nabízí optimální produktivitu a výkonnost. Během chodu analyzátoru lze kdykoli doplnit reagencie, špičky, destilovanou vodu, kyvety, vylít odpad, odstranit použité špičky či kyvety, přidávat vzorky, přednostně vložit statim. Analyzátor je 24 hodin připraven k práci. Advia Centaur (Bayer) 1 chlazený zásobník reagencií • 2 3 reagenční jehly • 3 inkubační kotouč s kyvetami • 4 luminometr • 5 jehla pro dávkování NaOH • 6 odsávací jehla pro odpad • 7 dodávání kyvet • 8 promývací jehly • 9 magnety • 10 promývání • 11 jehla pro dávkování H[2]O[2] • 12 jehla pro dávkování pomocných roztoků • 13 vzorková jehla • 14 chlazený zásobník pomocných reagencií • 15 zásobník špiček • 16 prostor pro aktuálně dávkované vzorky • 17 vstup pro vzorky • 18 stojánek pro vzorky • 19 vstup pro statim • 20 výstup hotového vzorku • 21 softwarové ovládání analyzátoru Advia Centaur (Bayer) Vzorek je vložen do stojánku a ten je dán do vstupu pro vzorky. Stisknutím tlačítka START je stojánek posunován v řadě a vsunut do dávkovacího prostoru . Vzorková jehla nabere ze zásobníku pro špičky jednu špičku, nabere vzorek ze zkumavky a nadávkuje jej do kyvety v inkubačním kruhu. Ten je vyhříván na 37^oC a neustále se otáčí, čímž umožňuje takt zpracování 15 sekund. Kyveta se vzorkem se otočí k jehle, která event. dávkuje pomocný roztok dále ke 3 reagenčním jehlám, které nezávisle dávkují primární reagencie z primárních zásobníků. Kyveta se poté otočí k promývacím jehlám a promývací stanici. Magnetické částice jsou pomocí magnetů přichyceny na stěnu kyvety, promývací jehly odsají tekutinu z kyvety a magnetické částice jsou promyty destilovanou vodou, která je opět odsáta. Inkubační kruh posune kyvetu k jehle, která dávkuje peroxyd vodíku a poté k výtahu, který dopraví kyvetu do luminometru. Ten má 3 části: fotonásobič, jehlu, která dávkuje NaOH a jehlu, která odsává vše do odpadu. Po přidání NaOH, proběhne chemiluminiscenční reakce. Luminometr měří emitované světlo v relativních světelných kvantech a ta převádí na výsledky / koncentrace. Elescys (Roche) • Analyzátor ELECSYS 2010Ò je plně automatizovaný softwarově řízený systém. • Systém je založen na technologii Elektrochemiluminiscence (ECL), dosahující mimořádné citlivosti, širokého měřícího rozsahu a rychlosti stanovení • Jedná se o benchtop analyzátor s kapacitou 86 testů za hodinu. • Operační systém je založen na vkládání dat prostřednictvím unikátního dvourozměrného čárového kódu . Elescys (Roche) • ELECSYS 2010Ò je uzavřený systém a používá výhradně systémové reagencie, kalibrátory a roztoky firmy Roche • Elecsys 2010 se vyrábí ve dvou variantách-Disc a Rack • Reagenční disk obsahuje 18 pozic pro reagenční soupravy, předzpracující reagencie a diluenty - najednou může být založeno maximálně 15 různých metod v jednotlivých pozicích Elescys (Roche) Dávkování vzorků a reagencií • přístroj je vybaven funkcí detekce hladiny, ale i detekce případné sraženiny či pěny • promíchávání magnetických mikročástic zajišťuje přesnost a integritu dávkování vzorků a reagencií • jednorázové špičky - minimalizují kontaminace • 3 zásobníky špiček po 120 ks a 3 zásobníky cupů Elescys (Roche) Inkubační jednotka 37 ·C ± 0,5 ·C • Zde probíhá vlastní imunochemická reakce mezi vzorkem a reagenciemi • Délka inkubace – 9 , 18 nebo 27 minut • Po ukončení reakce je reagenční cup přemístěn na pozici pro dávkování reakční směsi do měřící cely. Elescys (Roche) Měřící jednotka • Je klíčovou jednotkou analyzátoru ElecsysÒ 2010 • Obsahuje fotonásobič, průtokovou měřící celu, magnetickou jednotku a zesilující obvod • Teplota je udržována na hodnotě 28 ·C ± 0,5 ·C. Elescys (Roche) • Elektrochemiluminiscence - proces při kterém vysocereaktivní látky reagují na povrchu elektrody a produkují světlo • Protilátka (příp. antigen) je označena rutenium(II) tris-bipyridylovým komplexem • K elektrochemiluminiscenci dochází po vložení napětí na elektrodu a reakci s tripropylaminem (TPA) Architekt i 2000 SR, Abbott ARCHITECT i2000/i2000SR • Systémy ARCHITECT i2000SR/i2000 - plně automatizované systémy poskytující vysoký stupeň flexibility • 25 metod, chlazený karusel • Velikost reagenčních souprav 100 a 500 testů • Automatické opakované testování, ředění a reflexe • Detekce kapalin, detekce sraženin • Použití čárových kódů • Možnost integrace s biochemickým analyzátorem ARCHITECT c8000 • Výkon systému je až 200 testů za 1 hodinu (400 pro i4000, 600 pro i6000 a 800 pro i8000) Architekt i 2000 SR, Abbott – detail distribučního systému Architekt i 2000 SR, Abbott - detekce Technologie ChemiFlex CMIA (chemiluminiscenční imunoanalýza na paramagnetických mikročásticích) - měření vyzařovaných chemiluminiscenčních emisí v reakční nádobce Stručný postup: 1. Změření pozadí po přídavku peroxidu vodíku 2. Dávkování NaOH (Trigger) do reakční nádobky 3. Zachycení emitovaného světla a jeho odvedení světlovodem do fotonásobiče (PMT) • Značení patentovaným akridiniem Optický systém Unicel Dxl 800 (Beckman Coulter) • kompaktní plně automatický uzavřený systém umožňující provádění imunoanalytických stanovení • založen na použití alkalické fosfatázy jako markeru • paramagnetických mikročástic jako nosiče protilátek resp. antigenů • luminiscenční detekci využívající přeměny dioxetanfosfátu na dioxetan • přístroj má vysokou detekční citlivost při širokém koncentračním rozmezí a velmi dobrou přesnost a reprodukovatelnost výsledků Unicel Dxl 800 (Beckman Coulter) • Výkon: Až 400 testů /hodinu Rychlé uvolnění vzorku ze systému - systém si vytváří vlastní interní alikvot. • Jednoduchá obsluha: Minimální „kontakt“ obsluhy s řídícím softwarem. Doplňování reagencií a spotřebního materiálu prostým provedením úkonu. • Nepřetržitý provoz Doplňování reagencií a spotřebního materiálu za plného provozu (bez nutnosti pauzy). Minimální údržba (5min.denně) Unicel Dxl 800 (Beckman Coulter) • Kontrola integrity vzorků – detekce sraženiny a bublin • Kompatibilita s biochemickými analyzátory Synchron LX® 20, UniCel® DxC s automatizací – preanalycká linka, Power Processor®, • Široká nabídka testů Axsym (Abbott) • Velmi rozšířený analyzátor • 80-120 testů/ hod • Měřící principy – MEIA, FPIA, REA a ICIA • Robustnost, • Dotyková obrazovka • Doba analýzy 15 - 20 min • Technologie zabraňující tvorbě pěny Axsym - procesní centrum Axsym - reakční nádobka Axsym (Abbott) MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay) - Enzymová analýza na mikročásticích • Vzorek se smíchá s reagenciemi, pak se inkubuje • Separace na skleněných vláknech matrice • Přídavek konjugátu s alkalickou fosfatázou • Přídavek substrátu – 4-methylumbelliferylfosfát (MUP) • Hydrolýza MUP s ALP • Fluorescence methylumnelliferonu Axsym (Abbott) FPIA – Fluorizační polarizace • Polarizační fluorescenční záření emitováno z indikátoru, kterým je značený analyt • Hodnota polarizace emitované fluorescence je úměrná rychlosti rotace molekuly • Rotace je úměrná velikosti molekuly – malé analyty rotují rychleji než komplexy • Měří se změna v polarizaci emitované fluorescence po vytvoření komplexu analyt-protilátka Immulite 2000 (DPC) Účinnost: • Výkon 200 testů • Random Access • 24 chlazených reagencií • Automatické opakování "out of range" vzorků Maximální integrace: • Primární zkumavky • LIS interface Immulite 2000 (DPC) • Detekce sraženin • Enzymově zesílená chemiluminiscence • Stanovení 3. generace • Dotyková obrazovka • Dlouhá doba inkubace – 35 nebo 70 minut Immulite 2000 (DPC) Princip měření: • Ke konjugátu vázanému na reakční kuličce a značenému alkalickou fosfatázou je přidán luminogenní substrát (adamantyl dioxetan fosfát) • Dojde k odštěpení fosfátu a ze substrátu vzniká nestabilní anion, při jehož rozkladu dojde k emisi fotonů (chemiluminiscenční reakce) Immulite 2000 - Chemická reakce substrátu AU3000i (Olympus) • Firma Olympus přichází na trh s imunoanalyzátorem až v roce 2005 • Pevná fáze – magnetické mikročástice • Detekce – chemiluminiscence prostřednictvím hydrolýzy AMPPD (derivát dioxetanu) • Enzym – ALP • 240 testů/ hod • Detekce sraženiny RAD 120, Radim RAD 120, Radim • Patentovaná technologie nazvaná “Pegasus” • Pevná fáze - železitan potažený zirkoniem • Částice se silnou vazebnou kapacitou k biologicky aktivním molekulám • Rychlá a efektivní separace • Fluorescenční detekce při 450 nm RAD 120, Radim - charakteristika • Kontinuální přidávání reagencií a vzorků za chodu • Primarní, sekundarní vzorky, pediatrické kyvety • Produktivita: až 120 testů/hod • Reflex test • Kalibrace – stabilní až 4 týdny • Archív pacientů • Operační systém - Windows Xp • Dotyková obrazovka Ukázka obrazovky se statusem inkubátoru, předřeďovacího stojanu a stojanů s kyvetami Speciální možnost stanovení – autoimunitní markery Kryptor (Brahms) • Jediný z uvedených analyzátorů využívá pouze homogenní imunoanalýzu • Odpadají promývací a separační kroky Princip měření: • Neradioaktivní přenos energie z donoru (kryptátová struktura s iontem europia v centru) na akceptor (chem. modif. protein) • Měření signálu emitovaného z imunokomplexu s časovým zpožděním • Měřený vzorek je ozářen dusíkovým laserem, následně donor (kryptát) emituje fluorescenční signál, po něm emituje signál akceptor Chemická analýza moče • automatizace od 80. let minulého století • přístroje využívají stanovení parametrů pomocí diagnostických proužků (suchá chemie) • semikvantitativní stanovení bilirubinu, urobilinogenu, bílkoviny, ketonů, hemoglobinu, leukocytů, dusitanů, pH, glukosy a specifické hmotnosti • standardizace měřící procedury • namáčení proužků x pipetování na jednotlivé reakční zóny • analýza na principu reflexní fotometrie Chemická analýza moče Reflexní fotometrie: • zdroj světla - světlo emitující diody • emitují světlo o různých přesně definovaných vlnových délkách – světlo pak dopadá v různých úhlech na reagenční zóny diagnostického proužku • světlo je odráženo na fotodiodu , která slouží jako detektor • intenzita odraženého světla závisí na vybarvení reakční zóny (od bílé zóny se odráží prakticky 100%, čím tmavší zóna, tím víc světla je absorbováno) Chemická analýza moče Příklady analyzátorů: • pro malé laboratoře - Miditron Junior, Urisys 1800 (Roche Diagnostic) Aution Mini (Arkray) • vysokokapacitní – Urisys 2400 (Roche Diagnostic) Aution Max (Arkray) Urisys 2400 (Roche Diagnostic) • plně automatický močový analyzátor pro střední a velké laboratoře • kazety s 400 vyšetřovacími proužky • snadné vkládání vzorků ve stojanech, posuv po pásovém dopravníku • identifikace vzorků integrovanou čtečkou čárového kódu • pozice pro statimové vzorky • minimální objem vzorku 1.5ml Průtoková cytometrie UF 100 (Sysmex) • vzorek moče je automaticky naředěn a obarven a obklopen kapalinou neobsahující žádné buňky • prochází měřící celou, kde je ozářen argonovým laserem • fluorescence a rozptyl světla vznikající po ozáření se detekuje a je specifická pro jednotlivé buňky • výsledky jsou vydány jako počet buněk /ul (erytrocyty, leukocyty atd.) • nevýhoda - jednotlivé částice nemůže obsluha prohlížet Grafický výstup z přístroje UF 100 (Sysmex) IQ 200 (IRIS) – mikroskopická analýza • plně automatizovaná mikroskopická analýza • 60 vzorků/hod • možnost prohlížení částic na obrazovce • možnost přeřazení do jiné kategorie • přístroj rozlišuje 12 základních kategorií (např. erytrocyty, leukocyty, epitelie, válce) a umožňuje tvorbu podkategorií • archivace zobrazení IQ 200 (IRIS) Princip přístroje: • tenká vrstvička vzorku sendvičovitě uzavřená mezi vrstvy suspendované tekutiny se dostává do mikroskopu, který je spojen s digitální kamerou. • kamera s využitím stroboskopu zachytí 500 obrázků z jednoho vzorku - výsledný obraz je digitalizován • jednotlivé obrazy částic jsou izolovány do rámečků – každá částice zvlášť Erytrocyty – zobrazení z IQ 200 Kompletní systém močové analýzy IQ 200 (Iris) v kombinaci s Aution Max AX-4280 (Arkray) • zjednodušení provozu • vložíme vzorek a získáme kompletní výsledek