Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 20: Základy lékařské virologie I – obecná virologie a DNA viry Co nás dnes čeká § Obecný přehled vlastností virů § Obecný přehled virologické diagnostiky § DNA viry obalené § DNA viry neobalené § Příště budou RNA viry, kterých je víc I. Obecná virologie Co jsou to vlastně viry? § Viry jsou nebuněčné částečky, vedou se diskuse, zda se vůbec jedná o organismy § Vznikly pravděpodobně z buněčných organismů specializací na parasitismus („odhozením“ přebytečných částí) § Stejně jako buněčné organismy se snaží o „zachování rodu“, potřebují k tomu ale buňku cizího organismu § Kromě lidských virů existují i viry zvířecí, rostlinné a viry baktérií (takzvané bakteriofágy) § Mezi viry nepatří priony – chyby v bílkovině Rozdělení virů I § Podle nukleové kyseliny rozdělujeme viry na DNA viry a RNA viry § Podle počtu vláken DNA/RNA jednovláknové (ss) a dvouvláknové (ds), u jednovláknových se ještě rozlišuje, zda se jedná o "plus" vlákno nebo "mínus" vlákno. § Podle přítomnosti virového obalu se jak DNA, tak i RNA viry dělí na obalené a neobalené. Rozdělení virů II § U virů se používá obdobná klasifikace jako u baktérií (zvířat, rostlin…), zpravidla se však nepoužívá dvouslovné označení § Například: § Čeleď: Herpesviridae § Podčeleď Alphaherpesvirinae § Rod: Simplexvirus (virus prostého oparu) § Druhy: HSV 1 a HSV 2 Rozdělení virů III Podle hostitelského organismu – některé ale mohou napadat např. člověka i určité zvíře § napadající člověka – antropopatogenní § napadající zvířata – zoopatogenní § napadající rostliny – fytopatogenní § napadající baktérie – bakteriofágy Bakteriofágy se využívají v bakteriologii k tzv. fagotypizaci. Existují také pokusy léčit pomocí fágů bakteriální onemocnění Příklad experimentální infekce myši virem lidské chřipky Virová částice – virion § Virion není buňka. Viriony mají menší rozměry než většina buněk včetně bakteriálních: nejčastěji 20–300 nm § Skladba virionu § nukleokapsida nebo jádro a kapsida § obal (u obalených virů) § u některých odlišná, atypická skladba (VHB) § Skladba virionu se mění v závislosti na tom, je-li virus právě v hostitelské buňce Nukleokapsida § je přítomna u všech virů § skládá se z nukleové kyseliny (DNA, RNA) a bílkovinné kapsidy § kapsidy mohou mít helikoidální (šroubovicovou), nebo kubickou symetrii. § viry s kubickou symetrií tvoří tzv. pseudokrystaly – pravidelné útvary, například tvaru pravidelného dvacetistěnu. Lipoproteionový obal § mají jej pouze obalené viry § je tvořen lipidickou dvojvrstvou, která pochází z hostitelské buňky (původně např. cytoplasmatická, jaderná membrána apod.) § v některých případech je obal připojen specifickou bílkovinou k jádru § obalené viry jsou méně odolné (hynou totiž při porušení obalu např. vyschnutím) Virus chřipky v elektronovém mikroskopu Životní projevy virů § Viry si samy netvoří své nezbytné bílkoviny § Viry se také samy nemohou množit § Pro jejich život je nezbytná hostitelská buňka § Ne každá buňka může být hostitelskou buňkou. Záleží na druhu organismu, ale i druhu buňky (např. neurotropní viry napadají jen nervové buňky) Množení (replikace) virů § probíhá buď v jádře (většinou u DNA virů), nebo cytoplasmě (většinou u RNA virů) hostitelské buňky. § před replikací se virus musí zbavit svých bílkovinných obalů § vlastní průběh replikace závisí na konkrétním typu daného viru (RNA/DNA, jednovláknové – ss/ dvouvláknové – ds). Jednotlivé možnosti replikace § U většiny DNA virů je DNA-polymerázami dotvořeno vždy komplementární vlákno § U hepadnavirů (VHB) je DNA přepisována do RNA, podle té pak reverzní transkriptázou vzniká zase DNA § U RNA virů se využívají RNA polymerázy § U retrovirů (HIV) se podle RNA tvoří reverzní transkriptázou DNA, která je přepisována buněčnou RNA-polymerázou Tvorba virových bílkovin § je nutná k tomu, aby se virus po replikaci mohl z buňky uvolnit a šířit se dál. § vlastní tvorba bílkovin opět probíhá různě podle toho, o který typ viru se jedná § v každém případě virus částečně využívá proteosyntetický aparát hostitelské buňky. Jednotlivé možnosti tvorby bílkovin § +ss RNA: je možná přímá translace § –ss RNA: musí se dotvořit + vlákno § ds RNA: z – vlákna se dotváří + vlákno § retroviry: reverzní transkriptázou se vytvoří DNA a pak už pracují buněčné polymerázy § ds DNA: zpravidla se podle – vlákna tvoří + vlákno RNA § ss DNA: dotvoří se druhé vlákno a pak je to už stejné jako u ds DNA Viry závislé na jiných virech Zvláštností jsou některé viry, které nemohou existovat bez spoluúčasti jiných virů § Adenoasociované viry (AAV) patří mezi parvoviry. Replikace je možná pouze za přítomnosti pomocného viru (adenoviru) § Virus hepatitidy D – delta agens – je viroid. Je to nekompletní částice, která je schopna přežití pouze v obalu viru hepatitidy B (tvořeném hlavně HBsAg). Viry a vnější prostředí, desinfekce § některé viry jsou hodně citlivé (např. HIV) § jiné jsou zato mnohem odolnější než bakterie (třeba rhinoviry). § mnohé desinfekční prostředky, které působí na baktérie, nepůsobí na viry nebo jsou nutné vyšší koncentrace; týká se to zejména neobalených virů. Účinné bývají jodové preparáty a peroxidy. § velmi odolné vůči desinfekci i vysokým teplotám jsou priony Viry jako původci lidských nemocí Dítě napadené cytomegalovirem Možnosti přenosu virů § Cesty přenosu jsou u virů rozmanité, jsou ovšem prakticky stejné, jako u bakterií § máme viry přenosné kapénkovou infekcí, fekálně-orální cestou, sexuálním přenosem, přenašečem (klíště, komár) či krví (injekce). § u většiny virů je také možný „vertikální“ přenos, to jest z matky na plod. Faktory patogenity § Na rozdíl od bakterií se u virů často nerozlišují jednotlivé patogenní struktury, spíše se virus jako celek považuje za patogenní částici. § Tomu odpovídá i boj s infekcí, kdy protilátky často celou virovou aktivitu neutralizují. § S tím také souvisí větší význam neutralizačních metod v diagnostice. Průběh virové infekce § u virů záněty probíhají jinak než u baktérií § souvisí to zejména s nitrobuněčným parasitismem virů § zejména je menší účast granulocytů, větší účast lymfocytů, a význam buněčné imunity § také složky nespecifické humorální imunity jsou odlišné (zejména interferony). Latentní infekce § hostitelská buňka sice umožní vniknutí viru do buňky § neumožní však jeho množení a uvolnění z buňky § zato umožní jeho přežívání v buňce nebo dokonce včlenění do chromozomu. § v některých případech může dojít později k aktivaci této latentní (skryté) infekce, takže infekce vlastně znovu vypukne § typické je to u některých herpesvirů. Viry a nádory § Některé viry mají zřejmě vliv na vznik některých nádorů, zejména EB virus (původce infekční mononukleózy – podílí se na vzniku Burkittova lymfomu) a HHV8 spolu s HIV (vznik Kaposiho sarkomu) § Příčinou je to, že virový promotor v těchto případech může aktivovat expresi onkogenů lidských buněk, která by jinak byla potlačena (neprojevila by se). Boj s viry I – antivirotika § Používají se jen u některých virů § Zpravidla jen dílčí význam v terapii § Mohou být celková či lokální (někdy i tatáž látka, např. acyklovir – HERPESIN) § Testování citlivosti in vitro zatím spíše experimentální § Z nejznámějších: acyklovir, famciklovir, ganciklovir (herpesviry), amantadin, rimantadin (chřipka), azidotymidin, PMPA (virus HIV) Boj s viry II – imunoterapie § Používá se možností pasivní imunizace (protilátky) i aktivní imunizace (očkování) § Z očkování pravidelného kalendáře: § Živé oslabené viry: spalničky, zarděnky, příušnice, dříve i dětská obrna (Sabin) § Neživé vakcíny: virová hepatitida B, dětská obrna (Salk) § Z ostatních vakcín: vzteklina (profylaxe, ne prevence), klíšťová encefalitida, VHA atd. § Z pasivní např. protilátky proti VZV, HBV Slovní hříčka: „Otevřel jsem okno, a dovnitř vletěl Enza“. Dovnitř vletěl Enza – „in flew Enza“ se čte stejně jako „influenza“ = chřipka Virologická diagnostika § Kultivace à izolace Vyžaduje živé buňky. § Mikroskopie: elektronoptická, optická jen k průkazu něčeho, co viry dělají in vivo či in vitro (inkluze, cytopatický efekt) § Biochemická identifikace nepadá v úvahu § Pokus na zvířeti zde splývá s izolací viru § Průkaz DNA – u virů > u bakterií § Průkaz AG ve vzorku – velmi běžný § Nepřímý průkaz – obvykle základem veškeré diagnostiky virů Nepřímý průkaz virů § Používá se hlavně KFR, různé typy neutralizací (HIT, VNT) a v poslední době především reakce se značenými složkami (hlavně ELISA) § Pozor! Ne vše, kde se jako vzorek použije sérum, je nepřímý průkaz! U systémových viróz je často agens (nebo jen jeho antigen) v séru přítomno, a pak se dá sérum použít i pro přímý průkaz Mikroskopie ve virologii § Elektronová mikroskopie je vhodná k.pozorování většiny virů. Je však velmi nákladná a není vždy dostupná § Optická mikroskopie se dá použít § K pozorování velikých virů (poxviry) § K pozorování buněčných inkluzí in vivo (Negriho tělíska u vztekliny) § K pozorování cytopatických efektů in vitro (řada různých virů) Izolace virů § Zvíře se používá dnes již méně často. Klasickým zvířetem je sající myše. § Vaječný zárodek je klasickou metodou § Amniová dutina § Alantois § Žloutkový vak § Chorioalantoidní membrána (pouze zde někdy pozorovatelný výsledek – tzv. poky) § Tkáňové kultury: LEP, HeLa, opičí ledviny a různé jiné. Některé viry dělají na TK cytopatický efekt (CPE) Jak prokážu virus, když ho není nijak vidět? § Bakterie při kultivaci tvoří viditelné kolonie, nebo aspoň kalí bujón. Naproti tomu, jen někdy vidíme výsledek izolace viru (CPE, poky), mnohem častěji výsledek viditelný není § Izolovaný virus tedy musíme nějak prokázat, třeba průkazem antigenu § Klasickou metodou je Hirstův test – průkaz hemaglutinační schopnosti viru (hlavně u kultivace na vejci), nebo podobný hemadsorpční test (u kultivace na TK) Shell-vials techniky § Jde o techniky urychlené kultivace. § Inokulum se centrifugací vmasíruje do buněčné kultury narostlé na kulatém krycím sklíčku § Pomnožený virus se dokazuje pomocí imunofluorescence monoklonálními protilátkami § Celý postup je hotov do 24 h po přijetí vzorku (zatímco klasická kultivace trvá několik týdnů) II. Speciální virologie – DNA viry 1. Obalené DNA viry – poxviry § Největší viry, viditelné v optickém mikroskopu § Patřil sem virus pravých neštovic (orthopoxvirus, virus varioly), který byl v roce 1977 vymýcen čili eradikován § Patří sem virus vakcínie – kravských neštovic, kterým se proti pravým neštovicím očkovalo § Patří sem dále řada zvířecích virů § Patří sem také virus molluscum contagiosum (několikamilimetrové perleťové uzlíky, nezanícené, neškodné, přenos kontaktem) § Mají složitou symetrii, podobnou briketě Poxviry Virus molluscum contagiosum Eradikace pravých neštovic § Podílel se na ní významně prof. Ježek z Prahy § Byla umožněna tím, že neštovice nemají zvířecí hostitele, a že se nevyskytují bezpříznakové případy, které by mohly uniknout pozornosti § Podařila se díky očkování a izolaci nemocných § Poslední ložiska byla zničena v SV Africe § Po eradikaci byly neštovice uchovávány na několika místech na světě. V Anglii se však nakazil laboratorní personál § Dnes se viry neštovic uchovávají pouze v USA a v Rusku (pro případ epidemie) Virus pravých neštovic 2. Obalené DNA viry – herpesviry § Jsou to poměrně velké viry s kubickou symetrií kapsidy a obalem § Často mají afinitu ke kožní, nervové a lymfatické tkáni. Některé se „plazí“ po nervech jako hadi (herpetologie = nauka o hadech) § Dělí se na tři podčeledi § Alphaherpesvirinae (HSV1, HSV2 a VZV) § Betaherpesvirinae (CMV, HHV6 a HHV7) § Gammaherpesvirinae (EBV a HHV8) § Kromě těchto osmi lidských virů existuje ještě spousta zvířecích Herpesvirus Schéma herpesviru Viry prostého oparu (herpes simplex; simplex = prostý, jednoduchý) § Existují dva typy – HSV1 a HSV2. První by měl způsobovat hlavně herpes labialis, druhý herpes genitalis § Ve skutečnosti dnes herpes genitalis způsobuje častěji HSV1 než HSV2. Na druhou stranu, do chronicity přechází na genitáliích pouze infekce HSV2, u herpes labialis zase HSV1 § Diagnostika: klinická, případně izolace viru § Projevuje se bolestivými puchýřky. Vzácné a závažné jsou infekce oka § Léčí se acyklovirem, famciklovirem a valaciklovirem. Neodstraní však latentní infekci. Virus prostého oparu Herpes labialis Herpes genitalis Herpes simplex: životní cyklus Herpes simplex příznaky Herpes simplex komplikace Oční formy infekce Herpes simplex: léčba Shora: famciklovir, valaciklovir, acyklovir Virus neštovic a pásového oparu § Obě nemoci způsobuje jeden virus § Do organismu vniká dýchacími cestami, pomnoží se v mízních uzlinách a šíří se krví. Primární infekce se projevuje jako plané neštovice. Pásový opar je latentní infekce, aktivizovaná např. stresem. § Diagnostika obtížná. Kultivace na lidských embryonálních buňkách, případně ELISA § Léčba acyklovirem, valaciklovirem a famciklovirem. Varicella zoster virus (VZV) Neštovice Neštovice Pásový opar Cytomegalovirus § Název odvozen od zvětšení infikovaných buněk § Do těla vniká různými cestami. Šíří se krví. Primární i aktivovaná infekce se u většiny lidí nijak neprojevuje. § Závažná je infekce u těhotných (proniká přes placentu a napadá plod), u osob s poruchou zejména buněčné imunity (včetně infekce HIV), u osob po transplantaci apod. § Diagnostika: serologie + izolace viru § Léčba (je-li potřeba): ganciklovir, foskarnet Cytomegalovirus Cytomegalové inkluze v buňkách (akridinová oranž) Projevy CMV v krevním obraze CMV retinitis Serologická odpověď u CMV Viry šesté dětské nemoci (roseoloviry, virus exanthema subitum, HHV6A, HHV6B a HHV7*) § Tyto infekce probíhají nejčastěji děti ve věku šest až devět měsíců. Přenos kontaktem. § Infekce HHV6 a HHV7 je neurčité onemocnění s horečkou, jen někdy také vyrážkou. Reaktivace jsou bezpříznakové, s výjimkou příjemců transplantátu a jiných imunodeficitů. § Diagnostika ELISA, imunofluorescence § Léčba výjimečně ganciklovirem či jinými léky HHV6 Exanthema subitum neboli roseola infantum Virus Epsteinův – Barrové (EBV, lymphocryptovirus, virus infekční mononukleózy) § Do těla vstupuje ústy. Napadá lymfocyty B a narušuje různé složky imunity. Může poškodit také játra. Příznaky nemusí být žádné, nebo angína, postižení jater aj. Je rakovinotvorný. § Přenáší se líbáním, protože je vylučován slinou § Diagnostika: Paul-Bunnellova reakce – důkaz protilátek shlukujících beraní krvinky, nebo průkaz specifických protilátek proti různým virovým antigenům (hlavně EBNA a VCA) § Léčba: spíše symptomatická EB virus Infekční mononukleóza HHV 8 – Rhadinovirus (virus spojený s Kaposiho sarkomem) § Obsahuje neobvykle velké množství genů, pocházejících z hostitelské buňky (molekulární pirátství). To souvisí s jeho onkogenitou. § Primární infekce může připomínat infekční mononukleózu, ale bez heterofilních protilátek § Zřejmě má souvislost s Kaposiho sarkomem, zvláštním typem nádoru u pacientů s AIDS § Diagnostika je zatím spíše experimentální HHV8 na tkáňové kultuře Kaposiho sarkom Výskyt Kaposiho sarkomu ve světě Diagnostika – PCR 3. Neobalené DNA viry – Adenoviry § Poprvé byly izolovány 1953 z vyříznuté adenoidní vegetace (nosní mandle) § Zahrnuje viry lidské, zvířecí a ptačí § Jsou středně velké (80 nm), neobalené, symetrie kapsidy je kubická. Mají tvar dokonale pravidelného dvacetistěnu. Kapsida je složena z 240 hexonů a 12 vrcholových pentonů. § Je známo 47 serotypů adenovirů, které mohou být patogenní pro člověka. Ty se mohou lišit příznaky i možností diagnostiky Adenovirus Lidské adenoviry § Mohou vyvolávat rýmy, záněty hltanu, záněty spojivek (od lehčích až po závažné) § Typy 40 a 41 (lišící se také tím, že se nedají kultivovat) způsobují průjmy malých dětí § Jeden typ také může způsobovat zánět močového měchýře s krvácením § Diagnostika může být kultivační (na tkáňových kulturách) a serologická (komplementfixace) § Cílená léčba není možná Adenovirus Adenoviry 4. Neobalené DNA viry – papilomaviry § Vyskytují se u různých obratlovců, ale jsou druhově specifické § Mají kulovitý tvar s kubickou symetrií, velikost kolem 55 nm, kapsida má 72 kapsomer (60 hexavalentních a 12 pentavalentních) § Způsobují proliferaci plochého dlaždicového epitelu (papilomy, bradavice). Ty se mohou zvrhnout v karcinomy, ale jen zcela výjimečně § Nedají se běžně kultivovat § Jsou vysoce rezistentní k vyschnutí Papillomavirus Lidský papilomavirus (HPV) § Mohou vyvolávat lokální infekce, které zůstávají v bráně vstupu. Mohou to být bradavice na různých částech kůže, nebo stopkaté výrůstky zvané condylomata accuminata (neplést s condylomata lata u syfilis!), které se vyskytují na genitáliích a u řiti § Příznaky se liší podle genotypu – těch je asi 70 § Souvisejí zřejmě s karcinomem čípku § Diagnostika histologická + průkaz DNA (PCR) § Antivirotika nemáme, prevence očkováním Condylomata accuminata 5. Neobalené DNA viry – Parvoviry § Nejmenší DNA viry, měří jen kolem 20 nm (latinsky parvus = malý) § Jsou velice odolné vůči vnějšímu prostředí § Parvovirus B19 (erythrovirus) vyvolává pátou dětskou nemoc – megalerythema infectiosum. Dítě vypadá, jako by ho někdo zfackoval. Diagnostika je serologická § AAV – dependoviry (s adenovirem asociované viry) se množí jen v přítomnosti adenoviru. Není známo, že by měly negativní vliv na hostitele, naopak snad zamezují vzniku některých nádorů Parvoviry Ostatní DNA viry § Polyomaviry jsou podobné papilomavirům. Jsou dva lidské polyomaviry: BK, který se zaměřuje na močový trakt, a JC, který způsobuje nemoci CNS, zejména u HIV + osob § Cirkoviry jsou viry drůbeže a prasat § Cirkovirům podobné viry TT, TLMV a SENV snad souvisejí s některými záněty jater u člověka, ale neví se to jistě. Pravděpodobně se vyskytují i u zdravých osob, tedy jako normální flóra (byly by to první takové viry) § Virus hepatitidy B probereme s hepatitidami Děkuji za pozornost