Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 27: Odběr, transport a zpracování různých typů vzorků k mikrobiologickému vyšetření Ondřej Zahradníček 777 031 969 zahradnicek@fnusa.cz ICQ 242-234-100 Co nás dnes čeká §Povídání o diagnostice vzorků z určité lokalizace – společné zákonitosti a zásady §Povídání o odběru a transportu vzorků z jednotlivých lokalizací §Povídání o diagnostice vzorků z jednotlivých lokalizací „Odečítání“ bakteriologie C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Fotoatlas\Klinická mikrobiologie\Klin4.jpg Foto: archiv MÚ Přehled procesu vyšetření Proces mikrobiologického vyšetřování – na všem záleží!!! PACIENT/LÉKAŘ LABORATOŘ Indikace vyšetření – zda, jaké Vlastní provedení odběru Transport materiálu Rozhodnutí, jak zpracovat Vlastní zpracování materiálu Zaslání výsledku Interpretace v kontextu ostat. výsledků a stavu pacienta (léčit vždy pacienta, ne nález) 1A Indikace – ZDA provést nLékař, ke kterému přišel pacient k vyšetření, by se měl zeptat sám sebe: „Co udělám jinak v.závislosti na výsledku vyšetření?“ nPokud zjistí, že ať vyjde vyšetření jakkoli, bude jeho další postup ve vztahu k pacientovi stejný, je vyšetření pravděpodobně zbytečné nToto ale neplatí u epidemiologických indikací (třeba začátek epidemie chřipky) a také u profylaktických indikací (jako je screening mikrobiálního osídlení pacientů v těžkém stavu) §Rozhodnutím, že lékař chce provést vyšetření, to zdaleka nekončí. Musí se ještě rozmyslet, jaké vyšetření se rozhodne provést. §Musí znát spektrum patogenů a možnosti jejich vyšetření §Součástí je také rozhodnutí o tom, jak technicky se odběr provede, do jaké nádobky či odběrové soupravy a podobně 1A Indikace – CO provést Tři typy patogenů (1) §Patogen typu Streptococcus pyogenes. Nemusí se vědět, že se myslí zrovna na tohoto patogena, ale musí se přesně vědět, kde je jeho předpokládaná lokalizace. §Patogen typu Mycobacterium tuberculosis. Musí se vědět, kde patogena hledat, a zároveň i to, že se hledá právě tato skupina patogenů. §Patogen typu Toxoplasma gondii. Nemusí se vědět, kde se patogen v těle nachází, ale musí se vědět, že se hledá právě on. Tři typy patogenů (2) §Patogen typu Streptococcus pyogenes. Týká se kultivovatelných bakterií a kvasinek §Patogen typu Mycobacterium tuberculosis. Stále je to přímý průkaz, ale speciální postupy, při běžné kultivaci se nezachytí. Mykobakteria, gonokoky, legionely, plísně, paraziti apod. §Patogen typu Toxoplasma gondii. Nepřímý průkaz, event. přímý průkaz virového antigenu. Spirochety, viry, chlamydie, mykoplasmata aj. Odbě1 Foto: O. Z. 2 Vlastní odběr vzorku 3 Transport vzorku do laboratoře §Tyto fáze nelze oddělit – odběr je nutno činit již se zřetelem na transport materiálu do laboratoře §Jednotlivé typy vzorků budou probrány dále §Nelze zapomenout na správné vyplnění průvodky Průvodka §Správně vyplněná průvodka je základ dobré diagnostiky – je vodítkem, jaké vyšetření se má provést a jak §Laborant není pasivním prvkem, který trpně opíše to, co je na průvodce napíše. Naopak – dobrý laborant si umí všimnout chybně vyplněné průvodky, volat na oddělení a požadovat doplnění Průvodka 1 §Správně vyplněná průvodka je velice důležitá! §Osobní údaje: podstatné kvůli pojišťovně, ale i kvůli identifikaci, komu poslat výsledek apod. §Přesný popis materiálu a požadovaného vyšetření §nepsat pouze „výtěr“, když není jasné, odkud §ani „stěr z rány“ nestačí (jaká rána, kde lokalizována) §Katetrizovaná moč × moč z permanentního katetru §uvést, zda je požadováno např. anaerobní vyšetření §nepožadovat vyšetření, které nelze provést nebo nemá smysl (např. serologické vyšetření TBC) Průvodka 2 – co uvést §skutečnou diagnózu, je-li více, napsat tu, která souvisí s vyšetřením, popř. všechny /např. (1) diabetes mellitus, (2) poševní výtok/ §akutní / chronický stav / kontrola po léčbě §uvést stávající nebo uvažovanou antibiotickou terapii, případně i alergii na antibiotika Průvodka 3 – co ještě uvést §cestovatelská anamnéza – návrat z tropů §pracovní anamnéza – práce v zemědělství aj. §u serologických vyšetření datum prvních příznaků, první / druhý vzorek §u gynekologických materiálů fázi menstruačního cyklu (a při menses raději neodebírat) §v případě mimořádných vzorků se dohodnout, telefonicky 4 Rozhodnutí, jak zpracovat nJe dáno standardními operačními postupy (SOP). Pro každý typ vzorku je dáno v SOP, jak má být vzorek zpracován a jaké metody na něj mají být aplikovány nNe vždy je ovšem vše dáno SOP. Zvláště ve vzácných a mimořádných případech je na rozhodnutí zkušeného laboranta či VŠ mikrobiologa, jak vzorek zpracovat nV důležitých případech není naprosto chybou zatelefonovat do laboratoře a domluvit se. §Vlastní zpracování zpravidla zajišťují laboranti, dříve se SŠ vzděláním, nyní s VOŠ nebo Bc. stupněm vysoké školy 5 Vlastní zpracování (1) Desf1 nPostupuje se vždy přísně asepticky, aby se omezilo riziko laboratorní kontaminace. Práce v biohazard boxu je zároveň i dobrou prevencí profesionálních nákaz Foto: archiv MÚ §Zpracování bakteriologických kultivačních vzorků obvykle zahrnuje následující §před vlastním zpracováním se některé vzorky homogenizují, centrifugují či jinak upravují §u některých typů vzorků rychlé postupy – mikroskopie, popř. přímý průkaz antigenu §téměř vždy je základem kultivace na několika pevných půdách (KA + Endo + popř. další) §někdy též pomnožení v tekuté půdě (v případě výtěrů ze spojivky POUZE tento bod) §Zpracování jiných vzorků (serologie, PCR, mykologie, parazitologie) je speciální a je dána typem vyšetření a povahou vzorku 5 Vlastní zpracování (2) C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Fotoatlas\Klinická mikrobiologie\Klin5.jpg Laboratoř klinické bakteriologie Mikrobiolog (VŠ) „odečítá laboratoř“ – prohlíží výsledky kultivací Laborant 1 zapisuje výsledky Laborant 2 „dělá opáčka“: u pozitivních vzorků připravuje testy citlivosti a testy bližšího určení mikroba Foto: archiv MÚ 6 Zaslání výsledku §Výsledek je zaslán poté, co je dokončen diagnostický proces. Někdy je poslán předběžný výsledek („mezivýsledek“) po ukončení aerobní kultivace s tím, že to, co trvá delší dobu (kultivace kvasinek, anaerobů apod.) bude případně zasláno dodatečně §Výsledek už v sobě zahrnuje kus interpretace: mikrobiolog se vyjadřuje k evidentním kontaminacím, náhodným nálezům, běžné flóře, komentuje nález v poznámce Zaslání výsledku – organizace §zorganizovat tak, aby nedocházelo ke zbytečným prodlevám §dnes zpravidla možnost využít zasílání vzorků elektronicky (v rámci zdravotnického zařízení i mezi zařízeními navzájem) §lékař dohodne s mikrobiologem (nebo napíše na průvodku), zda má být zaslán až konečný výsledek nebo i mezivýsledek §dohodnout, kam má být výsledek poslán, je-li při odběru známo, že bude pacient přeložen 7 Interpretace §Definitivní interpretace nálezu v rukou lékaře. Pouze on, nikoli mikrobiolog, totiž drží v.rukou vedle mikrobiologického nálezu také biochemický, rentgenový, ultrazvukový, a především zná pacienta – vypáčil z něj anamnézu, vyšetřil jej, popřípadě (u obvodních lékařů) jej zná dlouhodobě. §Samozřejmě, konzultace klinika a mikrobiologa je u závažných případů velice vhodná. Na druhou stranu nelze konzultovat každý nález. Interpretace – příklady lLaboratoř odfiltruje evidentní kontaminace. To, že výsledek není označen jako kontaminace, ovšem ještě neznamená, že o ni nemůže jít. lPoznámka ke kvantitě („ojediněle“, „masivně“) je užitečná, ale nesmí se ale přecenit lU vzorků z dutin normálně osídlených běžnou flórou je nezbytné chápat ekosystém mikrobů jako celek, nemoc je často porušením rovnováhy mezi mikroby a léčba antibiotiky nemusí být nutná §Interpretace serologických vyšetření §samotná přítomnost protilátek není zpravidla významná §důležitější je titr a jeho změny v čase §u moderních reakcí (ELISA) poměr IgM × IgG; na indexu pozitivity zase tolik nezáleží Pozitivní výsledek – ale co znamená? §Nalezený mikrob může být §skutečný patogen §součást běžné flóry – trvalé či přechodné §náhodný nález (např. z potravy u výtěrů z krku) §kontaminace §Lékaři jsou rádi, když má „jejich laboratoř“ hodně pozitivních výsledků. §Mohou to ale být náhodné kontaminace, kolonizace apod. §Lepší je laboratoř, která nevydává za „nález patogena“ to, co patogenem s největší pravděpodobností není §Léčit neexistující infekci je chyba Průběžná spolupráce mezi klinickým pracovištěm a laboratoří lNejde jen o domluvu o konkrétních vzorcích! Spolupráce může mít nejrůznější formy lod občasných konzultací až po součinnost při výzkumné práci lje oboustranně užitečná lklinikovi pomáhá při rozhodování lmikrobiologovi zase dává konkrétnější představu o pacientech, jejichž vzorky mu procházejí rukama. Typy vzorků Typy vzorků v klinické mikrobiologii §Tekuté a kusové vzorky představují odebrané tkáně, tělní tekutiny, tekutiny, kterými bylo vyplachováno, umělé materiály vyňaté z těla a podobně §Stěry a výtěry jsou odběry vatovým tamponem na špejli či drátku §Ostatní vzorky: otisky, urikulty, sklíčka apod. §Každý typ vzorku vyžaduje jiný přístup, jiné zpracování, jiné hodnocení výsledku. Jak různé typy vzorků ovlivňují vyšetření §Vzorky typu výtěr ze spojivkového vaku. U zdravého člověka mikroby nejsou, i malá množství mohou být významná. Není vhodné nebo možné přímo očkovat na pevné půdy, proto se nejprve pomnoží v půdách tekutých §Vzorky typu rána. Opět u zdravého člověka mikroby nejsou, i malá množství mohou být významná, zároveň je však třeba rychle zachytit případná velká množství. Očkuje se zároveň na tekuté i pevné půdy, často různorodé pevné půdy. §Vzorky typu výtěr z krku. U zdravého člověka obsahují běžnou flóru. Pomnožení v tekuté půdě nemá smysl, dává se na různé pevné půdy. Výtěry a stěry §Dnes již prakticky neexistuje kultivační indikace suchého tamponu bez transportního média. Tento tampon je indikován praktický výhradně pro vyšetření metodou PCR a některé průkazy antigenů §Používají se tedy transportní média. Na bakteriologii je to zpravidla médium Amiesovo (na obrázku) §Speciální média vyžadují houby (Fungiquick), houby + trichomonády z genitálií (C. A. T.), viry, chlamydie §Potřebuji-li se dostat „za roh“, použiji tampon na drátu a nikoli na špejli. amies Foto: archiv MÚ Některé odběrové soupravy CAT Fungiquick §zleva: §CAT §FungiQuick §souprava na chlamydie §suchý tampon s.drátem Chlamydia Tampon s drátem Foto: archiv MÚ Odběrové soupravy ještě jednou Odbě2 Foto O. Z. Přehled „výtěrovek“ Tampon v Amiesu na drátku: totéž, potřebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo Tampon v Amiesu na špejli: univerzální pro bakteriologickou kultivaci (vč. anaerobů, kapavky, kampylobakt.) Suchý tampon na drátku: totéž, potřebuji-li se dostat na jinak nedostupné místo Suchý tampon na špejli: průkaz antigenu a DNA Fungiquick – houby C. A. T. – houby a trichomonády (stěry z pohlaví) Soupravy s médiem na viry, popř. chlamydie Odběrové nádobky §Odběrové nádobky se používají na kusové a tekuté vzorky. Na rozměrech fakticky příliš nezáleží, stejně tak barva uzávěru nemá samozřejmě reálný dopad. Má však někdy význam organizační – záleží na dohodě v rámci konkrétní laboratoře §U anaerobní kultivace je lépe zaslat přímo stříkačku s.jehlou zabodnutou do sterilní gumové zátky §Vzorky se snažíme vždy dopravit do laboratoře co nejdříve, zásadní je to však u moče – do dvou hodin Příklady nádobek §Vlevo klasická zkumavka, např. na sérum, vpravo kontejnerek na střevní parazity Zkumavka sérová Na parazity Foto: archiv MÚ Co se například posílá, a jak rychle se to musí dopravit §Moč – do dvou hodin, pokud nelze, nutno dát do ledničky (výjimka!!!) §Sérum (srážlivá krev) – na čase tolik nezáleží, ani na teplotě (ale lépe nechat v ledničce) §Punktáty, exsudáty, různé podobné tekuté materiály – co nejrychleji, ale není dán přímo časový limit. Nelze-li zpracovat hned, je lépe nechat při pokojové teplotě, ne do ledničky! §Odstřižené katétry – vhodné zalít bujonem či fyziologickým roztokem, aby nevyschly. I zde je vhodné rychlé zaslání event. pokojová teplota. Jiné typy odběrů než „výtěrovky“ a odběrové nádobky §nátěr na podložní sklíčko: kapavka, aktinomykóza, přímo zaslaná tlustá a tenká kapka apod. §v kožním lékařství otisky přímo na kultivační půdu, která je pro tento účel nalita až po okraj Petriho misky §urikult – zvláštní způsob zasílání moče na půdu; z různých důvodů se příliš neujalo. §rychlé diagnostické soupravy, většinou založené na přímém průkazu antigenu; jednoduchá manipulace, dostupná i pro nemikrobiologický personál. Při pochybách o výsledku použít klasické zaslání do laboratoře. Odběry a zpracování různých typů vzorků Dýchací cesty 02 Throat_swab_P7251230 Výtěr z krku http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Microbiology/Strep_Detection/Throat_swab_P7251230.jpg Odběr vzorků na vyšetření z dýchacích cest §Na bakteriologii se posílají §výtěry – (z krku, tonzil, nosu apod.), vždy na tamponu v transportní půdě (např. Amiesově) §sputum, tracheální aspirát či bronchoalveolární laváž u bronchitid a pneumonií §hemokultury u pneumonií §Viroví původci se většinou nevyšetřují. Je-li výjimečně potřeba je vyšetřit, volíme např. výplachy z nosohltanu a bronchoalveolární laváže speciálním médiem, či krev na serologii respiračních virů §Na mykologické vyšetření volíme výtěr na tamponu v soupravě FungiQuick 01 sputum1 Vyšetření sputa Co se se vzorky děje v laboratoři §Většina výtěrů se kultivuje na krevním agaru. Na ten se umisťují disky, jejichž cílem je odclonit běžnou flóru a umožnit záchyt patogenů. Kvůli hemofilovi, který na KA roste jen v přítomnosti např. zlatého stafylokoka, se na agar očkuje stafylokoková čára §U sput apod. se také provádí mikroskopie §Kromě KA se užívají další půdy, např. Endova §Virologické vzorky se izolují na vajíčkách či tkáňových kulturách, nebo se hledá antigen §V serologických vzorcích se hledají protilátky Vyšetření sputa Diagnostické schéma (1) §Den 0: mikroskopie (Gramovo barvení) §Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA, EA a NaCl. Je-li přítomna jen běžná flóra, EA se vyhodí a KA a NaCl se prodlužuje do dalšího dne. Případný patogen se určuje a testuje se jeho citlivost; je-li ho málo dělá se jeho izolace (kolonie se opatrně nabere kličkou a naočkuje se na celou misku křížovým roztěrem tak, aby se určitě získal čistý kmen Vyšetření sputa Diagnostické schéma (2) §Den 2: expedice negativních výsledků (prohlížení „prodlužek“, jak říkáme u nás, či „dohřívek“, jak říkají v nemocnici na Homolce). Expedice většiny pozitivních výsledků, je-li bližší určení hotovo a test citlivosti uspokojivý. Není-li, nebo je-li hotova teprve izolace, „jede se dál“. §Den 3: expedice většiny zbylých pozitivních výsledků (rezistentní, špatně určitelné, z izolací) §Den 4: výjimečně expedice posledních výsledků Výtěr z krku Diagnostické schéma §Den 0: pouze nasazení kultivací §Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA a EA. NaCl se zde nepoužívá. I v tomto případě se KA s běžnou flórou prodlužují §Den 2: expedice všech negativních a většiny pozitivních výsledků §Den 3: expedice téměř všech zbylých pozitivních výsledků Záchyt patogena v krku či sputu Očkování krku Kultivační výsledek výtěru z krku s běžnou flórou Klin7 Klin9a V těchto místech pátráme po hemofilech www.medmicro.info Co je potřeba vědět §Na průvodku je nutno uvést, o jaký vzorek jde, jaké vyšetření je požadováno, a případně další podstatné údaje §Laboratoř má právo odmítnout špatně odebraný vzorek sputa (nehnisavý, neobsahuje leukocyty, jen epitelie à jsou to sliny!!!) §Kultivace tuberkulózy musí být požadována zvlášť, i když se posílá stejný vzorek sputa §U virologie a průkazů různých antigenů se případně posílají suché tampony, výplachy z.nosohltanu (izolace viru) a podobně Trávicí cesty Odběr a transport stolice na jednotlivá vyšetření §Bakterie – v Amiesově transportní půdě §Kvasinky – v půdě FungiQuick §Viry – vzorek velikosti lískového oříšku; má-li být provedena izolace viru, je nutno chladit §Paraziti – opět velikosti lískového oříšku, nemusí být sterilní. Označit cestovatelskou anamnézu! Zpravidla tři vzorky. §Roupi – Grahamova metoda – perianální otisk na speciální lepicí pásku, mikroskopuje se § §Otravy – zvratky, zbytky jídel Diagnostika bakteriálních původců §Přímý průkaz toxinu A (Clostridium difficile) jako antigenu. Průkaz toxinu je důležitější než samotný nález klostridia – to mohou mít i zdraví! §Kultivace na různých půdách (výběr závisí na stáří pacienta a diagnóze) §U cestovatelů přidáváme i méně obvyklé půdy F:\Prezentace\www_oxoid._cz.jpg www.oxoid.cz Den 0. (přijatá stolice) §Negativní výsledek je za 48h §Pozitivní za 72h a déle selenit 24hod 48hod identifikace endo endo XLD MAL MCs KA Nacl CCDA CIN + 72hod 42°C 28°C *Není-li uvedeno jinak kultivace probíhá při 37°C Kultivace stolice Schéma: Lenka Černohorská Identifikace bakterie §Bakterie kultivujeme na různých půdách, na kterých mají charakteristický vzhled §Bakterie dále identifikujeme biochemickými testy §V některých případech (salmonely, escherichie) je žádoucí antigenní analýza vypěstovaného kmene Proteus mirabilis 27 PRMI http://www.icbm.de/pmbio/mikrobiologischer-garten/pics/pat05.jpg Průkaz enterotoxikóz §Nestačí kultivační průkaz mikroba §Vždy nutný průkaz toxinu (pokud není dostupný v nejbližší mikrobiologické laboratoři, lze požádat o spolupráci např. referenční laboratoři §Pokud možno vyšetřit i vzorek jídla Močové cesty Odběr a transport moče §Nejspolehlivější je moč získaná suprapubickou punkcí. V praxi se ovšem používá málokdy §Poměrně dobrá je také katetrizovaná moč (katetrizace provedená kvůli odběru) §Běžně odebraná moč nemusí být špatným vzorkem, je-li správně odebrána a zaslána §Moč z permanentního katetru je k ničemu, s.výjimkou případu, kdy chceme zjistit osídlení katetru Permanentní katetr (lepší obrázek jsem na internetu nenašel) 05 PERMAKATR%20HL www.globalrph.com/antibiotic/uti.htm. Odběr moče spontánně vymočené §ze středního proudu moči spontánně vymočené (rutinní typ s rizikem sekundární kontaminace během odběru) §postup: nádoba pro odběr moči musí být sterilní, se širokým hrdlem (např. kádinka)*, poučený pacient si před odběrem důkladně omyje zevní genitálie vodou a mýdlem a otře si zevní ústí močové trubice tamponem smočeným v dezinfekčním roztoku (u dětí se použití dezinfekčního roztoku nedoporučuje). *pokud ale pacient močí přímo ve sprše, může močit přímo do zkumavky, a poté se omyje pacient i zkumavka zvenku, a odpadá další manipulace Odběr moče u muže a ženy §Muži jedním krouživým tahem §Ženy zaujmou široký postoj nad klozetovou mísou, jednou rukou oddálí labia a druhou rukou tamponem otřou genitálie předozadním pohybem. Poté pacient odmočí první porci moče a do sterilní nádoby bez přerušení močení zachytí střední proud. Odebraná moč se přelije do sterilní nádobky určené k transportu. §(Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně, DOPORUČENÉ POSTUPY PRO PRAKTICKÉ LÉKAŘE, Projekt MZ ČR zpracovaný ČLS JEP za podpory grantu IGA MZ ČR 5390-3) Odběr moče u ženy Odběr moče Důležité je prsty odtáhnout malé stydké pysky od proudu moče tak, aby moč nebyla kontaminována mikroflórou vulvy Foto: archiv O. Z. Výjimky z pravidel o odběru moče §U podezření na záněty močové trubice se bere první porce moče (spláchnou se mikroby ze stěny trubice). §U zánětů prostaty se naopak hodí poslední porce moče §Poslední porce moče se zasílá také v případě podezření na parazitární infekci (např. schistosomózu) Transport moče §Pro hodnocení močové infekce je důležitá kvantita – viz dále. Tu však lze hodnotit pouze v případě, že se mikroby v moči během transportu nepomnoží – pokud se pomnoží, kvantitativní poměry se změní §Proto je moč bezpodmínečně nutno dopravit do laboratoře do dvou hodin po odběru (raději ještě rychleji) §Pokud zcela výjimečně toto nelze dodržet, je potřeba moč dát do ledničky (u jiných vzorků se to naopak nedoporučuje) Soupravy typu URIKULT §Smyslem těchto souprav je odstranit čas mezi odběrem moče a začátkem kultivace. Moč se odebere a ihned se do ní zanoří speciální destička s kultivačními půdami. Poté se moč vylije a půdy se začínají kultivovat (třeba přímo na oddělení) §Na těchto destičkách se však mikroby obtížně diagnostikují. Tato metoda se proto neujala tak, jak se od ní původně očekávalo §Pokud už se používají, je nutno bezpodmínečně dodržet správný postup Kvantitativní a semikvantitativní vyšetření moče •Při kvantitativním vyšetření se moč ředí a očkuje se na několik kultivačních půd •Při semikvantitativním vyšetření se moč neředí, avšak používá se kalibrovaná klička na jedno použití. Vyšetření je méně pracné, ale také méně přesné •Samozřejmě se hodnotí nejen kvantita, ale zároveň se normálním způsobem diagnostikuje, o kterého mikroba jde Semikvantitativní vyšetření I §Použije se kalibrovaná klička o objemu 1µl §To znamená, že při ponoření do vody či tekutiny s podobným povrchovým napětím ulpí v očku kličky právě jeden mikrolitr §Celý objem se rozočkuje na půl nebo celou misku s agarovou půdou §Poté se normálně inkubuje (24 h, 37 °C) §Druhý den se spočítají kolonie. Podle počtu kolonií se interpretuje výsledek §Používá se zpravidla krevní agar + jedna další půda. V naší laboratoři se v poslední době používá chromogenní půda URICHROM. Bakterie na půdě urichrom P1010007u Foto O. Z. Semikvantitativní vyšetření II §Počet kolonií po inkubaci odpovídá počtu CFU v 1 µl původní moče §CFU = colony forming unit, jednotka tvořící kolonii. Jednotlivý mikrob, dvojice, krátký řetízek, malý shluk. V praxi zanedbáváme rozdíl mezi mikrobem a CFU, říkáme tedy, že počítáme mikroby, i když ve skutečnosti počítáme CFU §Pokud tedy počet kolonií zhruba odpovídá počtu mikrobů v 1 µl původní moče, pak počet kolonií × 1000 odpovídá počtu mikrobů v 1 ml původní moče. 10 kolonií – 104 mikrobů v mililitru, 100 kolonií – 105 mik/ml Automatické kultivační systémy §Některé firmy dnes nabízejí automatické kultivační systémy, které detekují pozitivitu již po čtyřech hodinách a hlásí i antibiotickou citlivost (italský systém UroQuick). Některé, zejména soukromé laboratoře takové systémy vítají. §Tento přístup je však velice rizikový, protože antibiotická citlivost bez určení druhu bakterie je velice zrádná. Pokud je takový systém doplněn možností klasické diagnostiky, nemusí být nutně na škodu. Je však nepřípustné používat takový systém bez toho, aby jeho výsledky interpretoval mikrobiolog (např. umístění přístroje do biochemické laboratoře) 04 urine http://i96.photobucket.com/albums/l173/mbahmu/urine.gif Interpretace vyšetření moče I §Při nálezu jednoho druhu mikroba platí: §Kvantita nad 105 mikrobů v 1 ml se považuje za pravděpodobnou močovou infekci. U starých lidí to ovšem může být kolonizace §Kvantita 104–105 je hraniční. Jsou-li pochybnosti o kvalitě odběru (např. u kojenců), považuje se spíše za kontaminaci. Významná je spíše u mužů a u dětí. §Kvantita pod 104 se považuje za kontaminaci §Neplatí u punktované a katetrizované moči. Interpretace vyšetření moče II §Při nálezu dvou mikrobů platí §Kvantita do 105 je zřejmě kontaminace §Kvantita nad 105 je sporná (hraniční) §Při nálezu tří mikrobů platí §V podstatě vždy se považuje za kontaminaci §Výjimka: jeden mikrob v kvantitě nad 105, ostatní dva naopak pod 104 à první mikrob se považuje za pravděpodobného původce §V praxi se zohledňuje také o jaké mikroby jde apod. (stafylokoky se berou „méně vážně“) Diagnostika infekcí pohlavních, kožních, očních Odběry z genitálií §Ke kultivaci se používá transportně kultivační souprava C. A. T. (kvasinky a trichomonády) a Amies (bakterie včetně gardnerel, mykolplasmat a anaerobů). Z CATu se provádí mikroskopie ve formě nativního preparátu §Doporučuje se také poslat sklíčko nebo dvě sklíčka (podle situace) na barvení. Klasické zaslání dvou sklíček je MOP – mikrobní obraz poševní §V případě průkazu kapavky, syfilis, chlamydií, papilomavirů se užívají zvláštní postupy Odečítání kultivací z pohlavních orgánů (laboratoř MÚ FN USA) §Den 0 – odběr a zaslání vzorku, případná mikroskopie zaslaného sklíčka §Den 1 – odečet KA, EA, popř. ČA + GC (kapavka) §Den 1 – 2 – odečet C. A. T. (trichomonády) §Den 2 – odečet NaCl, gardnerel, anaerobní kultivace, popř. ČA + GC (definitivně) §Den 1, 2, 3, 4 – odečet kultivace kvasinek §Den 5 – odečet kultivace mykoplasmat* *Mykoplasmata se odečítala šestý den, avšak díky bakalářské práci studentky Radky J. se prokázalo, že pět dní stačí. MOP – mikrobní obraz poševní §Posílají se dvě sklíčka. Jedno se obarví dle Grama, druhé dle Giemsy (hlavně kvůli trichomonádám) §Hodnotí se jednak kvantita jednotlivých útvarů, jednak celkový vzhled preparátu. Staré hodnocení dle šesti typů se postupně přehodnocuje, spíše se hodnotí „BV“ a „AV“. §MOP I – tzv. normální obraz zdravé ženy §MOP II – bakteriální nehnisavý (i fyziologický) §MOP III – bakteriální hnisavý §MOP IV – kapavka §MOP V – trichomonóza §MOP VI – kvasinková infekce Bakteriální vaginózy (BV) §Bakteriální vaginóza je stav, kdy normální flóra poševní je narušena a v pochvě se nacházejí ve větší míře bakterie rodů např. Gardnerella, Mobiluncus, a anaerobní bakterie. Ty mohou být v pochvě i normálně, ale bývá jich méně §Nedá se určit jednoznačný původce §Téměř nejsou přítomny leukocyty (hnis). Některé bakterie totiž blokují jejich migraci do místa zánětu. V mikroskopii zato vidíme epitelie pokryté bakteriemi – clue cells §Léčba: metronidazol, úprava flóry Nugentovo skóre §Některé laboratoře využívají mikroskopický obraz poševní k tomu, že počítají tzv. Nugentovo skóre. Zde se „kladné body“ připočítávají za bakterie tvarově vypadající jako gardnerely (drobné gramlabilní tyčinky) nebo mobilunky (drobné zahnuté G- tyčinky) a odpočítávají za bakterie připomínající laktobacily. Skóre nad 10 znamená téměř jistou přítomnost vaginózy Aerobní vaginitidy (AV) §Vedle bakteriální vaginózy jsou možné i klasické (tj. leukocyty naopak obsahující) bakteriální záněty pochvy (kolpitidy; nesprávně utvořený pojem vaginitida se bohužel oficializoval) §Je však velmi obtížné odlišit původce zánětu od náhodného nálezu nebo kolonizace pochvy §Nejčastěji nalézáme enterobakterie, enterokoky, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus §Léčba závisí na přítomnosti příznaků, s.výjimkou Streptococcus agalactiae (zde se mimo těhotenství doporučuje spíše ženu přeléčit, kvůli přenosu na novorozence; v těhotenství už se ale nepřeléčuje) 02 N_b_ink_en MOP I (Giemsa). Přítomny laktobacily, Nugentovo skóre = 0 MOP II, bakteriální vaginóza. Laktobacily nahrazeny jinými tyčinkami, Nugentovo skóre = cca 8 Vaginóza www.medmicro.info MOP III (odpovídá dnešní AV) sputumgpko www.medmicro.info MOP IV (kapavka) 06 man_gn7_b_Gr 04 Trichomonas%20vaginalis1 MOP V (trichomonóza) MOP VI (Giemsa) – poševní mykóza 04 gr_5_b_ink_en MOP VI (Gram) C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Z internetu\Sestry a PA\STI a kožní\14 MOP candida200.jpg pathmicro.med.sc.edu/mycology/mycology-3.htm. Diagnostika nemocí s kožními projevy §U řady běžných dětských nemocí není laboratorní diagnostika nutná, nemoci jsou poznatelné klinicky §Pokud by se měly diagnostikovat, dělá se to zpravidla serologicky §U spály je podstatné vyšetření výtěru z.krku, které odhalí streptokoka §U skutečných kožních infekcí se provádějí stěry, otisky apod.; na mykologii se posílají šupiny aj. Kultivuje se běžným způsobem Diagnostika očních infekcí §V případě povrchových infekcí se posílají výtěry ze spojivkového vaku. V laboratoři se primokultivují pouze v bujónu §Při podezření na akantaméby je k vyšetření je nutno poslat celé kontaktní čočky v jejich tekutině, popř. provést seškrab rohovky §V případě hlubších infekcí se materiál na přímý průkaz odebírá jen tehdy, je-li to možné bez toho, abychom pacienta vyšetřením poškodili. V některých případech (toxoplasmosa) lze hledat protilátky. Diagnostika sepsí Hemokultury – odběr krve §Jedná se o nesrážlivou krev, principiálně zcela odlišné vyšetření než vyšetření serologická §Dnes zpravidla odběr do speciálních lahviček pro automatickou kultivaci §Nutno odebrat dvě, ale ještě lépe tři hemokultury při vzestupu teploty §Ideálně pokaždé z nového vpichu, nebo aspoň jedna venepunkce + centrální žíla + periferní žíla (odlišení bakteriémie od kolonizace vstupu) Zásady odběru krve §Odebírat asepticky!!! Nejen kvůli pacientovi, ale i kvůli vzorku. Nestačí očistit kůži benzinem, nutná desinfekce §Desinfekci nechat působit dostatečně dlouho, u alkoholových prostředků do zaschnutí (nechat skutečně zaschnout) §Nejlépe použít tři stejné hemokultivační nádobky. Případně doplnit např. jednou anaerobní §Hemokultury popsat, nezapomenout na čas odběru Pseudobakteriémie – příčiny §Nevhodně provedený odběr, nedostatek asepse při odběru krve §Odběr pouze ze zavedených vstupů (zachytí se bakterie kolonizující vstup, která však nemusí být původcem skutečné bakteriémie, natož sepse) Jak zamezit pseudobakteriémii – I §Odebírat hemokultury cíleně, když je přítomnost bakterií v krvi pravděpodobná, naopak neodebírat „z.rozpaků“ když je indikováno jiné vyšetření §Odebírat hemokultury v dostatečné kvantitě: jedna je k ničemu, i dvě jsou málo, tři je optimum §Odebírat hemokultury z vhodných míst: nejméně jednu z nové venepunkce, ideálně tři venepunkce plus odběr z žilního katetru §Odebírat hemokultury ve vhodnou chvíli, u septických stavů typicky při vzestupu teploty Jak zamezit pseudobakteriémii – II §Odebírat hemokultury správně, velmi důležité a často opomíjené je dodržení aseptického odběru (desinfekci nechat doopravdy zaschnout) §Odebírat hemokultury do správné soupravy: zpravidla není důvod posílat aerobní a anaerobní, není-li skutečné podezření na anaeroby. Odběr do lahviček s aktivním uhlím je nutný přinejmenším tam, kde je pacient již zaléčen antibiotikem §Doprovodit hemokultury dobře vyplněnou průvodkou: nutné je nejen datum, ale i čas odběru – pro interpretaci nálezu Jak zamezit pseudobakteriémii – III §U podezření na kontaminovaný cévní katetr se katetr mění. Starý katetr nevyhazujeme, nýbrž pošleme na bakteriologii. Dnes již existují metody schopné odhadnout, zda jde o skutečné osídlení katetru či náhodný nález §Totéž samozřejmě platí pro jakékoli implantáty, které se vyjímají z těla – jejich mikrobiologické vyšetření může přinést podstatnou informaci pro další léčbu Druhy kultivačních nádobek §Existují různé typy podle toho, které mikroby mají být především zachyceny (aerobní, anaerobní, kvasinky) §Některé nádobky obsahují aktivní uhlí. Jsou určeny ke kultivaci krve pacientů, kteří už berou antibiotika (klasická lahvička by mohla dát falešně § negativní výsledek – antibiotikum by § potlačilo růst) §Nejběžnější jsou aerobní standardní, aerobní s uhlím a anaerobní s uhlím. Příklady nádobek na hemokultivaci Kultivační flaštičky www.medmicro.info Fungování kultivátorů §Kultivátor, napojený na počítač, automatický udržuje optimální podmínky kultivace, a zároveň vyhodnocuje stav nádobky a indikuje případný růst (např. změna tenze CO2) §Růst je zvukově a opticky signalizován. Pokud ani po týdnu nic neroste, signalizuje to přístroj také (je třeba expedovat negativní výsledek) Automat na hemokultury BacTAlert - přístroj pro automatizování hemokultivace. Klikni! Foto: O. Z. Hemokultivační automat otevřený BacTAlert - přístroj pro automatizování hemokultivace. Klikni! Foto: O. Z. Když je hemokultura pozitivní… §Lahvička je vyjmuta z přístroje §Je nutno zaevidovat čas, resp. dobu od příjmu do pozitivity. Čím delší je tato doba, tím je pravděpodobnější, že jde o kontaminaci §Provádí se vyočkování na pevné půdy, nátěr na sklo barvený Gramem a podle jeho výsledku zpravidla „napřímo“ orientační diskový test citlivosti; místo standardní suspenze se použije přímo tekutina z lahvičky à není spolehlivé Další postup §Je třeba počítat s tím, že testy „napřímo“ jsou jen orientační, už pro nestandardní obsah baktérií v jednotlivých krvích. Zpravidla se proto v dalším kroku provádí řádné vyšetření citlivosti §Výjimkou jsou případy, kdy jde asi o kontaminaci (pozitivní jen jedna hemokultura ze tří, nebo pozitivní všechny, ale evidentně různé kmeny, pozitivita až za delší dobu, koaguláza negativní stafylokoky) E. coli v hemokultuře, fázový kontrast 04 E coli fázový konstrast http://www.visualsunlimited.com/browse/vu198/vu19873.html Cévní katetry §V případě pacientů se zavedenými katetry je vždy podezření na katetrový původ sepse §V takovém případě je nutno odebírat hemokultury jak z katetru, tak i ze zvláštních odpichů §Posílají se také odstřižené části katetrů, a je velmi důležité, jak budou vyšetřeny. §Klasická kultivace v bujonu: katetr se vloží do tekuté půdy a kultivuje 24 h. Je-li po této době bujon zakalený, je vyočkován na pevnou půdu a případné bakterie identifikovány. §Co se stane: Uvolní se bakterie v planktonické formě. Bakterie ve formě biofilmu se uvolní málo nebo vůbec. §Vzhledem k použití bujónu jako pomnožovací půdy nevíme nic o kvantitě (kontaminace × infekce). Klasické zpracování cévních katetrů §Semikvantitativní metoda: Bujon se oválí po povrchu pevné půdy. Co se stane: zmapujeme povrch katétru a semikvantitativně posoudit nález, nevypovídá však o bakteriích uvnitř a bakterie se nemusí uvolnit z biofilmu. §Sonifikace: biofilm rozbijeme ultrazvukem. Co se stane: rozrušíme biofilm na povrchu i uvnitř katétru. Vyočkování určitého objemu vzorku je kvantitativní metoda, takže dává možnost posoudit množství mikrobů. Nové možnosti zpracování katetrů Diagnostika systémových viróz (hepatitid, infekce HIV apod.) Systémové virózy §Základem je průkaz protilátek, případně také průkaz antigenu a průkaz DNA §Vyšetřuje se zpravidla sérum, a to nejen na průkaz protilátek, ale i virových antigenů §Na průvodku je vždy nutno přesně uvést, jaká vyšetření mají být provedena (nejen který virus, ale i jakými postupy – už kvůli proplácení pojišťovnou) Diagnostika neuroinfekcí Bakteriologická diagnostika purulentních meningitid §Vzorek: Mozkomíšní mok (Při odběru měřit tlak likvoru a prohlédnout jeho vzhled) §Po přijetí do laboratoře: §mikroskopie (hledají se leukocyty a bakterie) §přímý průkaz antigenu ve vzorku likvoru §kultivace: obohacené půdy (čokoládový agar) §Identifikace kmenů, u meningokoků až na úroveň séroskupiny kvůli očkování §Interpretace: pozor na kožní kontaminaci (koagulasa negativní stafylokoky) Diagnostika ostatních neuroinfekcí §Ostatní bakteriální infekce §U abscesů je nutno získat vzorek z příslušného abscesu, protilátky nemusí být vytvořeny §U borreliózy a neurolues je diagnostika serologická §Virové neuroinfekce §Přímý průkaz: Kultivace virů na tkáňových kulturách a na sajících myšatech; PCR. §Nepřímý průkaz: Dva vzorky krve na „serologii respiračních virů“ - provede se vyšetření protilátek proti nejběžnějším virovým, ale případně i bakteriálním agens. Diagnostika ranných, pojivových, hnisavých infekcí Odběry u hnisavých infekcí a infekcí ran §V diagnostice hnisavých infekcí má vždy větší význam tekutý materiál (hnis) než pouhý výtěr z hnisavého ložiska §U podezření na anaerobních infekci je nutno zajistit přežití anaerobů (viz dále) §Je nezbytné pečlivě vyplnit průvodku, nestačí „stěr z rány“, ale specifikovat původ rány i její lokalizaci na těle §Také důležité anamnestické údaje (návrat ze zahraničí, práce v zemědělství) je užitečné na průvodku uvést 03 wound%20close-up%202 Výtěr z rány http://www.kinseyracingschool.com/Images/wound%20close-up%202.jpg Diagnostika hnisavých infekcí §V laboratoři je provedena mikroskopie vzorku, dále jeho kultivace, bližší určení odhalených patogenů a vyšetření jejich citlivosti na antibiotika §U mikroskopie se hodnotí nejen mikroby, ale i množství leukocytů apod. §Při kultivaci je užitečné využívat pomnožovací tekuté půdy (kdyby bylo mikrobů málo) a také selektivní půdy (s.NaCl na stafylokoky, s amikacinem na streptokoky), zejména u dekubitů apod. Výtěr z rány: Základní diagnostické schéma (bez anaerobů, kvasinek aj.) §(Liší se dle lokalizace rány a dalších okolností) §Den 0: pouze nasazení kultivací §Den 1: výsledek primokultivace vzorku na KA, EA, NaCl a KA+AMI. V případě negativity všech pevných půd se prohlíží B, je-li zakalený, vyočkovává se (tzv. subkultivace) §Den 2: expedice všech negativních a mnohých pozitivních výsledků – pro komplikace, rezistence apod. ovšem zdaleka ne všech §Den 3: expedice dalších pozitivních výsledků Výtěr z rány – interpretace §Běžná flóra: žádná není, vše, co se najde, se považuje za patogena (pro jistotu i to, o čem máme pochybnosti, není-li to kontaminace) §Patogeny: všechno možné, od stafylokoků přes streptokoky a pseudomonády až po anaeroby u břišních ran a pasterurelly u ran po pokousání psem. Proto se doporučuje s atb léčbou vyčkat až po alespoň předběžném výsledku kultivace Závěr §Jak je vidět, u různých typů infekcí se posílají různé vzorky, a jsou tu různé požadavky na průvodky §Nemůžeme chtít po klinických lékařích ani po zdravotnických sestrách, aby se ve všem neomylně vyznali. Mikrobiologové i laboranti v mikrobiologických laboratořích jsou povinni být nápomocni, posloužit spíše dobrou radou než nadáváním „zase jste to odebrali blbě“. Nashledanou příště! C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Focené\Fotoatlas\Klinická mikrobiologie\Klin2.jpg www.medmicro.info