OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Základy klinické cytogenetiky – chromosomy Hanáková M. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SHRNUTÍ PŘEDNÁŠKY •chromosomy •metody přípravy chromosomových preparátů, hodnocení chromosomů, metody molekulární cytogenetiky •vrozené chromosomové aberace •onkocytogenetika OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SCHEMA LIDSKÉ BUŇKY •buněčné jádro img003 cytoplasma s organelami OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno interf buňka DEFINICE KLINICKÉ CYTOGENETIKY •klinická cytogenetika • zabývá se analýzou chromosomů • - počtem • - morfologií • - vztahem mezi nálezy chromosomových • změn a fenotypovými projevy chromosomy = spiralizované molekuly DNA normální počet chromosomů člověka = 46 DNA rozptýlená v buněčném jádře mitóza OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADERNÝ MATERIÁL •chromatin – komplex DNA s chromosomovými proteiny • (pojem používaný pro interfázi – klidovou fázi • buněčného cyklu, stupeň spiralizace jednotlivých • molekul DNA je nízký, chromatin vyplňuje celý • objem jádra, hranice mezi jednotlivými molekulami • DNA není zřetelná) • •chromosom – chromatin spiralizovaný v mitóze • (mitóza je proces dělení jádra, při kterém dochází • ke spiralizaci molekul DNA za účasti proteinů, • vznikají lineární struktury chromosomy) • • pojmy chromatin a chromosomy - týkají se téhož jaderného materiálu, odlišnost ve stupni spiralizace v závislosti na fázi buněčného cyklu img001 img008 mitóza OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMATIN A CHROMOSOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromosomů •během buněčného cyklu •se chromatin nachází •v různých fázích •spiralizace •(v interfázi nízký stupeň •spiralizace, během mitózy •postupná kondenzace, •maximální v metafázi •mitózy) • spiral DNA OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno schema chr spiraliz text p kr ram text centrom text q dl ram text CHROMOSOM lineární struktura schema chr schema chr spiraliz (zaškrcení – primární konstrikce) sesterské chromatidy jednoho chromosomu = identické kopie, tvoří 1 molekulu DNA v metafázi mitózy 1 chromatida = 1 spiralizovaná dvoušroubovice DNA OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI schema chr 12-8 chromosom ve světelném mikroskopu schema chromosomu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI karyotyp •soubor chromosomů jedince nebo buňky, označujeme jejich počet, typ pohlavních chromosomů a případné aberace •normální lidský karyotyp se skládá ze 46 chromosomů, z toho 22 párů autosomů (nepohlavních chromosomů) a 2 gonosomů (pohlavních chromosomů) •chromosomový pár je tvořen homologními chromosomy, z nichž jeden je zděděn od otce a druhý od matky, nepárové chromosomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) • norm mužský OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÁPIS KARYOTYPU •46,XX - normální ženský karyotyp •46,XY - normální mužský karyotyp počet chromosomů v jádrech buněk jedince typ pohlavních chromosomů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální karyotyp norm mužský norm normální mužský karyotyp 46,XY normální ženský karyotyp 46,XX OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno HISTORIE KLINICKÉ CYTOGENETIKY klasické metody analýzy •vznik moderní lidské cytogenetiky • - datuje se od roku 1956, kdy byl stanoven počet lidských • chromosomů a byly vyvinuty efektivní metodiky • analýzy chromosomů • •klasická konvenční metoda barvení chromosomů • (chromosomy obarveny po celé délce – lze třídit • chromosomy podle velikosti a polohy centromery) • •pruhovací metody (1968-70) • (proužky na chromosomech, které umožňují • individuální rozlišení jednotlivých chromosomů • a chromosomových změn) dlouhý2 zlomy1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY - metody 1. volby v indikovaných případech - relativně levné metody (ve srovnání s metodami molekulární cytogenetiky) •odběr materiálu •kultivace – získání suspenze buněk – směs buněk v mitóze (spiralizované • chromosomy) a buněk v interfázi •zpracování suspenze – zastavení dělení jader buněk v metafázi mitózy mitotickým jedem • kolchicinem (chromosomy zůstanou ve spiralizovaném stavu – • proces dělení dále nepokračuje) • - hypotonizace – ze suspenze buněk odstraníme erytrocyty – buňky • bez jádra, zvětšení objemu jader buněk s chromosomy • - fixace – rozpuštění cytoplasmy buněk • získání suspenze jader (směs jader s chromosomy a jader v interfázi) • - vykapání suspenze jader na podložní sklíčko •pruhování / barvení chromosomů • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu • Odběr materiálu pro účely cytogenetického • vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • •do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) •do heparinu a transportního média – kostní dřeň • (obv. 1-2 ml) •do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) •bez přídavku média a dalších látek – plodová voda • (obv. 20 ml) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu odebrané choriové klky odebraná periferní krev odběr plodové vody nasazení plodovky 003 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu kultivace4 inverzní mikroskop 2 kultivace periferní krve, délka 72 hodin kultivace plodové vody, délka kultivace asi 10 dní - délka kultivace se liší v závislosti na typu materiálu a vyšetření (bez kultivace (kostní dřeň) – několik týdnů (solidní tumory)) - podmínky kultivace se liší u různých materiálů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •aplikace kolchicinu • (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) • - zastavení dělení jader buněk v mitóze • jaderný materiál zůstane spiralizován ve formě • chromosomů, které jsou vhodné k analýze ocún fotky 005 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • •vykapání suspenze na sklíčka • kapání2 přednáška 090 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů • pruhování chromosomů • analýza karyotypu, karyotypu maligních klonů • • • mitóza chromosomy s G – pruhy – střídavé tmavé a světlé proužky různé tloušťky (G = barvení Giemsovým barvivem po předchozím vystavení chromosomů působení enzymu trypsinu, který natráví chromosomové bílkoviny na povrchu chromosomů) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY pruhování chromosomů •G – pruhování chromosomu č. 1 – vzor a reálný chromosom 1 vzor mpp skala spiralizace OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY význam pruhování chromosomů • rozeznáme chromosomy podobné morfologie (specifické pruhy každý chromosom) • lze zkontrolovat genetický materiál chromosomu po celé délce • zápis strukturních přestaveb – v zápisu strukturní přestavby jsou uvedena čísla pruhů na ramenech chromosomů, které vstoupily do přestavby, ve kterých došlo ke zlomu. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení přibližně •1250x za použití imersních objektivů přednáška 038 dlouhý2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno přednáška 059 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •světelný mikroskop •s CCD kamerou •napojený na počítač přednáška 054 přednáška 056 ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačového programu Lucia OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •karyotyp sestavený na počítačovém programu Lucia norm mužský OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) •významně se podílejí na mnoha případech poruch reprodukce, vrozených malformací, mentálních retardací •cytogenetické poruchy jsou přítomny přibližně u 0,7% živě narozených dětí OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (ABERACE) •vrozené chromosomové aberace (VCA) • (vyšetření karyotypu) – početní • - strukturní • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů •abnormality počtu chromosomů • -aneuploidie – nejčastější a klinicky velmi významný typ • chromosomových poruch • - abnormality počtu chromosomů v páru • - tento stav je vždy spojen s poruchou fyzického • nebo mentálního vývoje • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie •trisomie – nejčastější porucha • (přítomnost nadbytečného chromosomu v páru) • • trisomie autosomů - (trisomie celého chromosomu je jen vzácně • slučitelná se životem) • - Downův syndrom 47,XX,+21 (47,XY,+21) • - Edwardsův syndrom 47,XX,+18 (47,XY,+18) • - Patauův syndrom 47,XX,+13 (47,XY,+13) • • trisomie gonosomů - (fenotypové důsledky jsou méně závažné • než u trisomie autosomů) • - Klinefelterův syndrom 47,XXY (muž) • • • • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Edwards VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Downův, Edwardsův a Patauův syndrom •Downův syndrom • 47, XX, +21 Down Patau Edwardsův syndrom 47, XX, +18 Patauův syndrom 47, XX, +13 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonosomů Klinefelterův syndrom •Klinefelterův syndrom 47,XXY Klinefeltr OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie •monosomie – méně častá porucha • (chybění 1 chromosomu v páru) • - monosomie gonosomu X (Turnerův syndrom) • 45,X (žena), častý výskyt • • • turner OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby •strukturní abnormality chromosomů • •méně časté než aneuploidie •dochází k přestavbám a následně ke změnám morfologie chromosomů •předpokladem je vznik zlomů na chromosomech OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby •balancované přestavby - v sadě chromosomů je zachováno • normální množství chromosomového materiálu (žádný materiál • nechybí ani nepřebývá) • - většinou nemají fenotypové vyjádření (nejsou přítomny poruchy • fyzického nebo mentálního vývoje), v buňkách je přítomen veškerý • chromosomový materiál, i když v odlišném uspořádání • •nebalancované přestavby – část chromosomového materiálu • v karyotypu chybí (parciální, částečná monosomie) a (nebo) část přebývá (parciální trisomie) • - většinou dochází k fenotypovým abnormalitám OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, balancované translokace •translokace – nejčastější ze strukturních aberací, předpokladem • je vznik dvou zlomů, každý na jednom chromosomu • • • • • bal transl výměny segmentů mezi dvěma chromosomy OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace •translokace u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, •ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet •a s tím souvisejících potratů nebo narození potomků s nebalancovaným •karyotypem (parciální monosomie jednoho a parciální trisomie druhého •chromosomu) rodiče normální fenotyp, matka nositelka translokace dítě postižené, po matce zdědilo 1 derivovaný chromosom pocházející z translokace OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace •46,XX,t(16;21)(q22;q22.1) 46,XY,der(21)t(16;21)(q22;q22.1) • Škrdlová Škrdla rodič dítě OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, balancované inverze •inverze – na jednom chromosomu vzniknou 2 zlomy, segment • mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení • do chromosomu • • • • inv peric bez gam inverze u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet a narození abnormálních potomků • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, nebalancované delece •delece – vznik zlomů a ztráta úseku chromosomu, který způsobuje • vznik nebalancovaného karyotypu • (parciální monosomie) • • • term delece OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÁPIS KARYOTYPU 47,XX,+21 46,XX,t(8;21) nadbytečný autosom v jádrech buněk (početní změna) 45,X 47,XXY chybějící nebo nadbytečný gonosom v karyotypu (početní změna) inverze v karyotypu (strukturní změna) Příklady patologických karyotypů: •46,XX,inv(1) 46,XX,del(5) translokace v karyotypu (strukturní změna) delece v karyotypu (strukturní změna) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k postnatálnímu stanovení karyotypu (VCA) •problémy časného růstu a vývoje • neprospívání, opoždění vývoje, dysmorfická facies, mnohočetné malformace, malá postava, obojetný genitál, mentální retardace •narození mrtvého plodu a úmrtí novorozence • výskyt chromosomových abnormalit je vyšší u případů narození mrtvého plodu (téměř 10%) než u živě narozených dětí (asi 0,7%), zvýšený výskyt také u dětí, které umírají v novorozeneckém období (okolo 10%) •problémy s fertilitou • ženy s amenoreou, infertilní páry, opakované spontánní aborty, partneři před IVF •rodinná anamnéza • známá nebo suspektní chromosomová abnormalita u příbuzných •dárci gamet, děti k adopci • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k prenatálnímu stanovení karyotypu (VCA) •Věk matky (35 let v roce porodu, pod 18 let), věk otce (nad 40 let), součet věku rodičů (70 let) v kombinaci s další indikací •Patologické hodnoty biochemických markerů (biochemický screening) nebo patologický UZ nález u plodu •Přítomnost balancované vrozené chromosomové aberace u rodičů (nebo v rodině) •Předchozí porod dítěte s VCA •Po IVF •A další OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Metody molekulární cytogenetiky, příklady využití v klinické cytogenetice OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY •molekulární cytogenetika aplikuje metody molekulární biologie • na cytogenetické úrovni, vizualizuje a lokalizuje genetický materiál • v buňkách •pracuje s metafázními chromosomy nebo interfázními jádry •potvrzuje a upřesňuje nálezy klasické cytogenetiky • (metody klasické cytogenetiky – základní vyšetřovací metody, • metody molekulární cytogenetiky – metody s vyšší rozlišovací schopností) •začátek rozvoje – přelom 60.- 70. let 20. století •metodami klasické cytogenetiky (ve světelném mikroskopu) lze na chromosomech rozlišit strukturní změny pouze o určité velikosti (>5Mb) •změny menší lze detekovat metodami s vyšší rozlišovací schopností – metodami molekulární cytogenetiky • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY •molekulárně cytogenetickými technikami nelze nahradit klasické karyotypování • (před použitím metod molekulární cytogenetiky je třeba vědět, co chceme hledat – při klasickém karyotypování vidíme karyotyp jako celek za relativně nízkou cenu, vysoká cena molekulárně cytogenetických metod) •oblasti uplatnění FISH – klinická cytogenetika (postnatální vyšetření • u sterilních párů, postižených dětí a dospělých • s podezřením na genetickou příčinu onemocnění, • genetická analýza pro účely umělého oplodnění, • prenatální diagnostika karyotypu plodu) • - nádorová cytogenetika • - výzkum (evoluční studie karyotypu, mapování • genomu ...) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) je metoda umožňující přesnou detekci a lokalizaci specifických úseků DNA na chromosomech nebo v interfázním jádře pomocí vazby specifických krátkých molekul DNA - sond, které jsou označeny fluorescenční značkou. in situ – na původním místě (cílový úsek vizualizujeme na původním místě na chromosomu nebo v interfázním jádře na podložním sklíčku – pozorujeme ve fluorescenčním mikroskopu; (DNA analýza – izolujeme DNA, konkrétní úseky namnožíme (amplifikace), analyzujeme odděleně od ostatního genetického materiálu - jen část genu)) sonda (molekula DNA) fluorescenční značka sonda je komplementární k cílové sekvenci OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - FISH (fluorescenční in situ hybridizace) vazba sondy (próby) k cílovému místu na chromosomu nebo v interfázním jádře - sonda je značená fluorescenčně – FISH – fluorescenční in situ hybridizace sonda po navázání na cílovou DNA může být vizualizována – signál pozorujeme ve fluorescenčním mikroskopu, barevné záření vypovídá o místě vazby sondy sonda před označením fluorescenční značkou značená sonda vazba sondy na cílovou DNA vizualizace místa navázání sondy – fluorescenční záření OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) •vyhodnocení a zpracování signálu – FISH - fluorescenční mikroskop napojený na počítač – vizualizace a kvantifikace (signál září v tmavém poli) – modrá barvička (DAPI) obarvuje všechny chromosomy, červený signál = fluorescenčně značená sonda • FISH na metafázních chromosomech FISH na interfázních jádrech +21 fish trisomie chromosomu 21 (Downův syndrom) 1045-03 darkyne potvrzení přítomnosti translokace v karyotypu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) •chromosomy fluorescenčně značené hodnotíme ve fluorescenčním mikroskopu, zdroj •světla – krátkovlnná část spektra (např. rtuťová výbojka), krátkovlnné záření je •vysokoenergetické a je schopno vybudit fluorescenci ve fluorescenční značce zdroj krátkovlnného vysokoenergetického záření speciální filtry OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH •složitější metody, některé z nich (CGH, SKY, M-FISH) vypovídají o změnách v genetickém materiálu v celém karyotypu (nejen v jednotlivých specifických úsecích), které jsou detekovatelné na cytogenetické úrovni •pracují se směsí sond, která je specificky připravená pro danou metodu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) •zeleně označeny úseky na chromosomech, které jsou v karyotypu maligního klonu zmnoženy, •červeně označeny chybějící úseky chromosomů (obrázky převzaty z internetu) převaha červené fluorescence – křivka vychýlena za hranice intervalu spolehlivosti doleva (delece), převaha zelené fluorescence – křivka vychýlena doprava (nadbytek materiálu) metoda odhaluje nebalancovaný genetický materiál (chybění – nadbytek DNA) - systém fluorescenční mikroskop – kamera – počítač, analyzační software měří poměr fluorescence při vlnových délkách odpovídajících červenému a zelenému fluorochromu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) •SKY – mitóza po hybridizaci •se směsí sond značených fluorochromy SKY – seřazené chromosomy po úpravě obrazu objasnění složitých přestavech SKY 1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – M-BAND (mnohobarevné pruhování) •přestavby v rámci jednoho •chromosomu (inverze, delece) mband_karyo OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Nádorová cytogenetika OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA základy •zhoubné bujení je genetické onemocnění •vznik nádoru (maligní transformace) je mnohastupňový proces – zahrnuje sled genetických změn – mutace genů řídících buněčné dělení, růst a diferenciaci, buněčný zánik, reparaci DNA, přestavby na úrovni chromosomů a genomu, narušení integrity genomu (defekty v genech zajišťujících chromosomovou stabilitu a přesný rozchod chromosomů v mitóze) •maligní buňky mají během vývoje nádoru tendenci akumulovat chromosomové abnormality •chromosomové přestavby u onkologických pacientů řadíme k získaným aberacím (nikoli vrozeným) – vznikají v průběhu progrese onemocnění • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA protoonkogeny - onkogeny •protoonkogeny – normální geny přítomné ve všech buňkách, • jsou zahrnuty do procesů regulace buněčné • proliferace (buněčného dělení, růstu • a diferenciace) a reparace (opravy) DNA •onkogeny – mutované („aktivované“) alely protoonkogenů, • mutace vede k zisku funkce nebo změně funkce • (atypická aktivace). Usnadňují maligní transformaci. • •K aktivaci dochází v důsledku mutace. • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA tumor supresorové geny •tumor supresorové geny (antionkogeny) – normální buněčné geny, jejichž funkcí je zabraňovat nekontrolovanému dělení buněk. • Jejich onkogenicita se projeví při ztrátě funkce (inaktivaci) obou alel genu. • •K inaktivaci dochází většinou v důsledku delece. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA základy •vyšetření karyotypu maligních klonů z kostní dřeně • (klon – skupina buněk se stejnými genetickými změnami) • • •vyšetření metodami klasické cytogenetiky (G-pruhování) •vyšetření metodami molekulární cytogenetiky (FISH, SKY, CGH, M-BAND..) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn •chromosomové změny – početní • - chybění nebo nadbytek jednotlivých chromosomů – (typické jsou abnormality • jiných chromosomů než u VCA) • • • • • • • • • • +8 47,XX,+8 45,XX,-7 45,XX,-7 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn - chybění nebo nadbytek více chromosomů • chromosomové změny – početní kompl OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn •chromosomové změny - strukturní • často typické změny pro určité typy nádorů (jiná místa zlomů než u VCA) •– translokace – nejznámější translokace t(9;22) – Ph chromosom • (Philadelphský chromosom) u chronické myeloidní • leukemie (CML) •- inverze •- delece •- amplifikace - v buňce je přítomno mnoho • kopií genu • (normální počet genů na 1 chromosomu je 1) • (tato změna se nevyskytuje u VCA, • je typická pro onkologická • onemocnění) • • mnohokrát zmnožený onkogen sonda označující počet chromosomů, na kterých je gen lokalizován (centromera) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn • kombinace početních a strukturních chromosomových změn SKY 1 početní změny chromosomů translokace chromosomů strukturní změny OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn •nahromadění více chromosomových změn v karyotypu = • KOMPLEXNÍ KARYOTYP • • (charakteristický znak zhoubných nádorů zvláště • v pozdějších stádiích progrese nádoru) • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM ONKOCYTOGENETICKÉHO VYŠETŘENÍ •zpřesnění diagnózy •stanovení prognózy onemocnění •monitorování průběhu onemocnění (remise, relaps) •volba léčebného postupu, sledování úspěšnosti léčby • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Doporučená literatura •Klinická genetika, Thompson 2001 •Základy klinickej genetiky, Sršeň, Sršňová 1995 •Základy lékařské genetiky, Pritchard, Korf 2003 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno chromozomy Děkuji za pozornost