Optické metody Denzitometrie Vertikální fotometrie Reflexní fotometrie Denzitometrie lOptická metoda, která se zabývá měřením optické hustoty lReflexní denzitometrie – v odraženém světle lpřímá denzitometrie – v procházejícím světle Denzitometr lPřístroj, který slouží k vyhodnocení hustoty zbarvení v plošném uspořádání. Jedná se o postup, který je podobný fotometrickému stanovení (liší se v uspořádání), zaznamenává měnící se hodnotu absorbance v závislosti na intenzitě zbarvení lZdroj světelného záření: halogenová žárovka lMonochromátor: interferenční filtry lDetektor: fotonásobič Reflexní denzitometrie l lPrincip: měření intenzity záření odraženého od neprůhledné podložky. Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy l lPoužití: v tenkovrstvé chromatografii l Přímá denzitometrie lPrincip: lměření intenzity záření procházejícího průhlednou plochou, získává se grafický záznam fotometrovaného úseku. lJednotlivé frakce dělené směsi tvoří na záznamu v ideálním případě souměrné křivky zvonovitého tvaru. Plocha těchto píků připadající jednotlivým frakcím, je úměrná relativnímu zastoupení jednotlivých frakcí v dělené směsi. l lPoužití: při hodnocení elektroforeogramů l Denzitometr lElektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky lV místě frakcí dochází k částečné absorpci záření – to se projeví při dopadu na detektor lPo zpracování signálu integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých frakcí lNa jedné podložce je součastně vyhodnocováno až 30 elektroforetických drah Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 038 Elektroforeogram – elektroforéza v plošném uspořádání na agaróze Elektroforéza bílkovin v agarózovém gelu lDělí bílkoviny krevního séra na 5 (6) frakcí: lFrakce albuminu: tvořena jedinou bílkovinou lFrakce globulinové: lΑ1-globuliny: α1 lipoprotein, orosomukoid,α1antitrypsyn lΑ2-globuliny: α2 makroglobulin, ceruloplasmin, haptoglobin, pre-β lipoprotein lΒ1-globuliny:transferin, fibrinogen, C3, β – lipoprotein lB2-globuliny: C3 lgama-globuliny: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE http://www.sebia.fr/image_v2/courbe/puce/70_gb.gif Elektroforetické typy lNa základě charakteru rozdělení frakcí v elektroforéze - vymizení frakcí, objevení se nových frakcí, nebo jiný vzájemný poměr frakcí, lze usuzovat z určitého elektroforetického typu na určité skupiny chorob. (stavů) ELFO typ Elektroforetická frakce Albumin Globuliny a1 a2 b1 b2 g 1. Typ akutního zánětu Ô ÓÓ ÓÓ N (Ó) N 2. Typ chronického zánětu Ô Ó Ó N N ÓÓ*) 3. Typ chronické hepatopatie Ô Ô Ô Ô Ô Ó 4. Typ nefrotického syndromu ÔÔ N ÓÓ ÓÓ ÓÓ Ô 5. Typ malnutrice ÔÔÔ (Ó) N (Ó) N (Ô) N N 6. Typ monoklonální gamapatie Ô Kdekoli úzký proužek monoklonálního imunoglobulinu; g-frakce může zcela vymizet Typ akutního zánětu lCelková bílkovina je normální, lehké snížení albuminu, vzestup a1- a a2-globulinů, případně i b2-globulinů. lAkutní rozsáhlý zánět, především bakteriální. Nález je u všech akutních stavů (po operacích, úrazech, infarktu myokardu apod.). Akutní hepatitida. Aktivní zánět u revmatoidní arthritidy, u rychle rostoucích malignit (zhoubných nádorů). Typ chronického zánětu lPokles albuminu. Vzestup a1- a a2-globulinů (menší než u typu ad 1.), výrazný vzestup g-globulinů (široký pruh g-globulinů na elektroforeogramu). Jedná se o tzv. polyklonální hyperimunoglobulinémii. lChronické infekční choroby, zánětlivá onemocnění pojiva, autoimunitní choroby, maligní nádory Typ chronické hepatopatie lPokles albuminu, a1-, a2- a b-globulinů (t. j. bílkovin tvořených játry). Vzestup g-globulinů (především IgA, který se nalézá mezi g a b globuliny a tvoří tzv. b-g můstek mezi těmito frakcemi, g-globulinová frakce nasedá přímo na frakci b-globulinů) lTěžká fibróza až jaterní cirhóza, chronická hepatitida. Typ nefrotického syndromu (ztráty bílkovin) lVelký pokles albuminu. Pokles g-globulinů. Nárůst a2- a b-globulinů. (Ztráty především bílkovin s malou molekulou) lNefrotický syndrom (chronická glomerulonefritida, postižení ledvin při systémových onemocněních, diabetická glomeruloskleróza, amyloidóza, některá infekční onemocnění) Malnutriční typ lCelková bílkovina výrazně snížena. Velký pokles albuminu a b1-globulinů. lChybění aminokyselin, z toho vyplývající porucha syntézy bílkovin. Monoklonální gamapatie l lNižší koncentrace albuminu. Někde (tj. kdekoli) mezi a1- až g-globuliny se nachází úzký proužek monoklonálního imunoglobulinu. lNádorové onemocnění mnohočetný myelom. Waldenströmova makroglobulinémie, hemoblastózy, karcinom, plazmocytom aj. S věkem výskyt paraproteinů roste, ve stáří se i u zdravých lidí objevují benigní monoklonální imunoglobuliny, a to bez klinických příznaků onemocnění Vzácnější nálezy l lBisalbuminémie (zdvojení frakce albuminu), analbuminémie (chybí frakce albuminu), deficit a1-antitrypsinu (chybí a1-frakce), atransferinémie (pokles b1-globulinů), hypogamaglobulinémie (dědičný či získaný defekt syntézy imunoglobulinů); hemolytické sérum (projevy: posun a2-globulinů ke katodě, zvýšení b2-globulinů), fibrinogen (proužek mezi b- a g-globuliny), zvýšení b-lipoproteinů (LDL; intenzivní proužek v b-oblasti) HYDRASYS Zařízení pro elektroforézu: poloautomat HYDRASYS (fy SEBIA) HYRYS 2 Denzitometr HYRYS (fy SEBIA) Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 038 http://www.sebia.fr/image_v2/courbe/puce/70_gb.gif Význam denzitometrie lKvantitativní vyhodnocení jednotlivých frakcí získaných elektroforetickým dělením bílkovin v biologickém materiálu lVedle grafického výstupu (křivka elektroforeogramu) , vypočítává software denzitogranu procentuální zastoupení jednotlivých bílkovinných frakcí l Význam v diagnostice MG lELFO bílkovin s následnou denzitometrií má klíčový význam pro diagnózu MG l MG: jsou definovány jako skupina onemocnění, které jsou charakterizovány proliferací jednoho klonu plazmatických buněk produkujících homogenní imunoglobulin. Toto onemocnění má maligní nebo potenciálně maligní charakter Význam v diagnostice MG l V elektroforeogramu pátráme vizuálně po atypické zóně. V séru mohou mIg migrovat v širokém rozsahu od oblasti a2-globulinů až po katodický konec zóny gama-globulinů. l Normální rozsah migrace polyklonálního IgG je celá katodická část počínaje zónou b1, IgM – migruje v anodické zóne gama, IgA – migruje v iterzóně b1 a b2- globulinů. l Metodou volby pro identifikaci mIg v séru a moči je elektroforéza s vyšší rozlišovací schopností. (HR) l HR - elektroforéza lAutomatizovaný systém – Hydrasys (fy Sebia) lManuální postup podle Johanssona l lV obou případech probíhá dělení při vyšším napětí (15-20 V/cm) a elektroforeogram je delší (6-8 cm) l Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 040 Vertikální fotometrie Vertikální fotometrie lSpektrofotometrická metoda,s uspořádáním kdy světelný paprsek prochází optickým prostředím ve vertikálním směru l Využití : proměření absorbance (fluorescence) v jamkách mikrotitračních destiček, které se používají hlavně pro imunochemická stanovení na principu ELISA (analýzy s navázaným enzymem za využití imunosorbce) Vertikální fotometr l Reader mikrotitračních destiček, který měří absorbanci světelného záření l Princip l Světelný paprsek ze zdroje prochází přes zvolený interferenční filtr do optických kabelů, které zabezpečují distribuci do 9 oddělených kanálů. l 8 z nich vedou přes jamky mikrotitrační destičky a dopadají na pole fotodiod, které detekují intenzitu světla. Devátý optický kabel je použit na kontrolu intenzity záření vycházející ze zdroje. Vertikální fotometrie lVe zlomku vteřiny se změří celá řada jamek (8), lmikrotitrační destička se posune a může se měřit řada lnásledující lVýsledky měření závisí na přesnosti pipetování lJamka mikrotitrační destičky má konstantní plochu lkruhové základny a pro stejnou koncentraci je konstantní lsoučin absorbance a délky optické dráhy : l c l A1 . I1 = A2 . I2 = l a Vertikální fotometrie lVýhody lKdyž napipetujeme např. ke stejnému množství vzorku méně činidla, zkrátí se optická dráha roztokem (tj. tloušťka vrstvy roztoku), ale měřený roztok bude mít větší absorbanci a výsledná koncentrace bude stejná jako v prvním případě ltzn., že i při poměrně krátké optické dráze (asi 3 mm) a s dosti nepřesnými pipetami (chyba asi 10%) získáme solidní výsledky Vertikální fotometrie l Hlavní komponenty přístroje: lZdroj záření: halogenová žárovka lInterferenční filtry: umístěny v posuvném držáku filtrů, obvykle 6 (pro λ 400-800 nm) lOptický systém: 9 optických kabelů (světlovodiče) lDetektor: fotodiody l Rychlost měření: 5s Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 021 Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 018 Instr_tech_ELFO_Reader_mřížka 017 ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assays lPrincip: lReakce antigenu (analytu) s protilátkou. Protilátka, nebo antigen je určitým způsobem označen. lPři ELISA stanovení se ke značení protilátky (antigenu) používají enzymy (alkalická fosfatáza, peroxidáza, b-galaktozidáza), které po přidání substrátu do reakční směsi katalyzují reakci, na jejímž konci je barevná látka vhodná k fotometrické detekci. Schémata znázorňující značení protilátek a antigenů ve vazebných testech ELISA lHeterogenní imunoanalýza: vyžaduje separaci lvolné a vázané frakce indikátoru (značené lprotilátky, antigenu) lKompetitivní: se značenou protilátkou l se značeným antigenem lNekompetitivní: se značenou protilátkou l Heterogenní kompetitivní se značeným antigenem l Soutěživá reakce mezi stanovovaným antigenem a antigenem značeným enzymem o vazebná místa na protilátce. lPo separaci volné frakce a frakce vázané na protilátku proběhne detekční enzymatická reakce. lPlatí zde přímá úměra, čím více (neznačeného) antigenu ve vzorku, tím více komplexu s neznačeným antigenem a méně komplexu se značeným antigenem (více značeného antigenu zůstane nezreagováno v reakční směsi). Heterogenní kompetitivní se značenou protilátkou l V tomto případě je antigen navázán na pevnou fázi (stěnu mikrotitrační destičky) a dochází k soutěživé reakci s antigenem v neznámem vzorku o vazebné místo protilátky. lPromytím je z reakční směsi odstraněn nenavázaný konjugát l konjugát vázaný na pevné fázi je inkubován s enzymovým substrátem Heterogenní nekompetitivní ELISA – „sendvičová“ lPři nekompetitivním (tzv. sendvičovém) uspořádání je analyt vázán mezi dvě vysoce specifické protilátky (jako v „sendviči“). lJedna z nich je vázána na pevnou fázi ( jamku destičky), druhá je značená a přidává se až k vytvořenému komplexu. lPlatí, že čím více antigenu ve vzorku, tím více antigenu v komplexu a tím více značené protilátky v následném „dvojitém“ komplexu. ELISA - průběh 1.pipetování kalibrátorů, kontrol, vzorků 2.Inkubace: navázání antigenu ze vzorku na protilátku (ukotvenou na jamce mikrotitrační destičky) 3.Promytí: separace volné a vázané frakce 4.Přidání druhé protilátky značené enzymem 5.Inkubace: navázání druhé protilátky značené enzyme - vytvoření kompelexu Ab-Ag-Ab* l 1. 1. ELISA - průběh l6. Promytí l7. Přidání substrátu l8. Inkubace: dojde k barevné reakci mezi substrátem s enzymem l9. Přidání stop reagencie – zastavení barevné reakce l10. Stanovení absorbance l Reflexní fotometrie Reflexní fotometrie lPrincip lměření intenzity záření odraženého od neprůhledné (homogenně zbarvené) podložky. Hodnotí se poměr intenzity dopadajícího světla a světla odraženého od barevné plochy lPoužití: suchá chemie, močová analýza, denzitometrické hodnocení tenkovrstevných chromatografů Reflexní fotometr l Přístroj slouží ke kvantitativnímu vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi. Pevná fáze slouží jako nosič obsahující činidla aktivovaná vodou obsaženou v naneseném vyšetřovaném biologické materiálu (krev, moč). lMěří se intenzita záření odraženého od homogenně zbarvené podložky.(matrice) Reflexní fotometr - pevná fáze (matrice) lČinidla jsou v reagenční zóně proužku impregnována vlákna proužku (fy Roche, Reflekton) l lČinidla jsou nanesena v reagenční zóně proužku jako vícevrstevný film (fy Kodak) l Reflexní fotometr lOdraz světla od reagenční zóny: lzrcadlový – na reflexní ploše zrcadla ldifuzní - je výsledkem interakce dopadajícího světla s molekulami reakční zóny (zahrnuje i absorpci a rozptyl) l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lZdroj záření: lhalogenová lampa l xenonová výbojka lsvětloemitující dioda l l Hlavní komponenty reflexního fotometru lUlbrichtova koule (jako zdroj difuzního lsvětla): ldutá koule jejíž vnitřní povrch je potažen vysoce reflexním materiálem (síran barnatý). lSvětlo ze zdroje se po vstupu do koule mnohonásobně odráží od stěn a jako dokonale difuzní dopadá na reagenční plošku Hlavní komponenty reflexního fotometru lDetektor záření: luvnitř koule jsou umístěny dva detektory. lJeden měří světlo difuzně odražené od reagenční plošky a druhý je referenční l refl_fotometr urisys2400_new Reflexní fotometr pro chemické vyšetření moče pomocí diagnostických proužků Děkuji za pozornost