‹#› 1 Elektroforéza Petr Breinek ‹#› 2 Elektroforéza je analytická metoda založená na rozdílné pohyblivosti nabitých částic v elektrickém poli. Pohyblivost částic závisí na: • velikosti náboje • velikosti částice • vlastnostech prostředí ‹#› 3 Troška historie ØStanovení koncentrace celkových bílkovin ØStanovení koncentrace jednotlivých bílkovin ØStanovení izoenzymů, lipoproteinů,….. ØPrůkaz a kvantifikace patologických bílkovin Ø Od ELFO na „papíru“ přes EID, IELFO,… k imunofixačním technikám a ? ELFO dvojdimenzionální ELFO agar ‹#› 4 IELFO IELFO dvojrozměrná IELFO dvojrozměrná obr Imunoelektroforéza (IELFO) Dvojrozměrná imunoelektroforéza ‹#› 5 Elektroimunodifúze dle Laurella Není ELFO metoda: Radiální imunodifúze dle Manciniové (RID) RID IELFO raketky ‹#› 6 Využití pro stanovení: • Bílkovin v séru, moči, likvoru • Izoenzymů • Lipoproteinů • Hemoglobinů • DNA,… ‹#› 7 1.Zónová 2.Imunofixace 3.Izoelektrická fokuzace 4.Volná 5.Dvojrozměrná (two-dimensional) 6.Izotachoforéza 7.Imunoelektroforéza 8.Elektroimunoassay 9.Imunobloting/ Western Blotting 10. ‹#› 8 Zónová elektroforéza- nosiče: -Papír -Acetátcelulozové folie -Agarozový gel -Škrobový gel -Polyakrylamidový gel (PAGE,polyacrylamide gel electrophoresis) - - ‹#› 9 Postup (zjednodušeně) -Aplikace vzorků -Dělení -Fixace a barvení -Odbarvení -Sušení -Vyhodnocení - Elfo schema ‹#› 10 Instr ‹#› 11 Automatický elektroforetický přístroj Hydrasys (Sebia,Francie) ‹#› 12 ‹#› 13 ‹#› 14 ‹#› 15 30 PROTEINE ‹#› 16 IMMUNOFIXACE ‹#› 17 •Fáze při imunofixaci • •Elektroforéza •Aplikace specifických antisér • (proti těžkým řetězcům IgG, IgA, IgM a lehkým vázaným i volným kappa lambda řetězcům) •Odstranění nezreagovaných bílkovin •Barvení precipitátů,promývání a vysušení •Hodnocení • ‹#› 18 4 IF ‹#› 19 4 BJ ‹#› 20 PROTEINURIE ‹#› 21 5 PROTEINURIE ‹#› 22 LIPOPROTEINY ‹#› 23 ‹#› 24 IZOENZYMY ‹#› 25 15 ISO LD ‹#› 26 15 ISO CK ‹#› 27 IZOELEKTRICKÁ FOLUZACE (IEF) ‹#› 28 • • IEF je technika rozdělující bílkoviny podle jejich izoelektrických bodů •Dělení probíhá v lineárním pH gradientu vytvořeném amfolyty • Nosičem je agarózový nebo polyakrylamidový gel • ‹#› 29 • Příklad využití IEF •Stanovení oligoklonálních pásů IgG v likvoru • •Bez zahuštění likvoru •Současně se analyzuje sérum a likvor (ve stejné koncentraci) •Imunochemická detekce a barvení • • ‹#› 30 • • Stanovení oligoklonálních IgG pásů v likvoru a v krevním séru metodou izoelektrické fokuzace s následným imunofixačním barvením umožňuje kvalitativní vyjádření intratekální syntézy IgG. ‹#› 31 9 IEF a ‹#› 32 Typ 1 Normální nález Stejný polyklonální obraz v likvoru a v séru Typ 2 IgG intratekální syntéza Oligoklonální pásy v likvoru a žádné v séru Typ 3 IgG intratekální syntéza Oligoklonální pásy v likvoru a současně některé identické pásy v séru Typ 4 Bez intratekální syntézy Zrcadlový obraz- identické pásy v likvoru i v séru Typ 5 Bez intratekální syntézy Paraproteinový obraz- identické pásy IgG v krátkém úseku pH gradientu ‹#› 33 1_6 Hydragel CSF Hydragel CSF Isofocusing 1-6 du 170703 gb copier ‹#› 34 PAGE ‹#› 35 PAGE üDělení látek nejenom na základě velikosti elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul üGradient hustoty polyakrylamidového gelu üPřídavek SDS (laurylsíran sodný/dodecylsulfát sodný)způsobí, že všechny molekuly mají téměř stejný el. náboj a dělí se jen podle velikosti svých molekul ‹#› 36 Imunobloting/ Western Blotting ‹#› 37 Imunobloting/ Western Blotting üRozdělení v gelu üPřenos na nitrocelulózovou membránu obvykle elektrickým proudem üReakce přenesené látky v membráně s činidlem obsahujícím protilátku ü ü • Metoda je vhodná pro detekci jednotlivých bílkovin ve směsi ‹#› 38 Dvojrozměrná elektroforéza ELFO dvojdimenzionální ‹#› 39 Izotachoforéza ‹#› 40 Izotachoforéza ÑAnalytická kapilární izotachoforéza je elektromigrační separační technika umožňující analýzu ionogenních látek v roztocích. Vzorek je dávkován na rozhraní dvou elektrolytů o rozdílných pohyblivostech iontů. Směs se dělí při konstantním proudu v gradientu vysokého napětí. Po rozdělení směsi do jednotlivých zón jsou tyto zóny sevřeny mezi vedoucím a zakončujícím elektrolytem, nevzdalují se od sebe a až k místu detekce se pohybují stále stejnou rychlostí (izo-, tacho-). ‹#› 41 Kapilární elektroforéza ‹#› 42 Kapilární elektroforéza ÑJe technika založená na principu elektrokinetické separace v kapiláře malého vnitřního průměru (méně než 100 µm), naplněné elektrolytem při vysokém napětí (7 700 V). Ñ ÑVýsledkem je rychlá a velice účinná separace molekul s výborným rozlišením. ‹#› 43 PRINCIP KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY DETEKTOR Migrace Kontrolovaná teplota Pufr Pufr Zdroj vysokého napětí ‹#› 44 Kladný náboj z pufru Záporný náboj na stěně capiláry Elektro-osmotický tok (EOT) je mnohem silnější než elektrické pole. Ve výsledném efektu, jsou všechny bílkoviny unášeny ke katodickému konci kapiláry. Anoda + síla EOT Síla electrického pole Migrace bílkovin DETEKCE NASÁTÍ VZORKU ‹#› 45 CAPILLARYS ‹#› 46