‹#› LUMINISCENČNÍ metody Petr Breinek ‹#› 2 •Luminiscence = emise světla (fotonů) atomy a molekulami (luminofory), které se nacházejí v excitovaném stavu (elektron se vrací z excitovaného stavu nebo vyšší energetické hladiny na nižší energetickou úroveň - do základního stavu) ‹#› 3 Bioluminiscence v přírodě medúza Světlušky, medúzy, dřevokazné houby,hlubokomořské ryby,…… Princip: Luciferin + ATP ® Luciferyl adenylát (Luciferáza) Luciferyl adenylát ® Oxyluciferin + AMP + CO2+ světlo Reakcí jedné molekuly luciferinu je produkován jeden foton o vlnové délce odpovídající namodralému světlu. Při reakci se pouhé 4 % energie mění na energii tepelnou a zbytek, tedy 96 % energie je vyzářen. Světluška je tedy daleko účinnější zářič než běžná výbojka, která má tento poměr 9:1 (tedy jen 10 % energie přechází na světlo). ‹#› 4 Rozdělení (podle příčiny): •Fotoluminiscence (fluorimetrická stanovení) • - fluorescence • - fosforescence •Chemiluminiscence • - bioluminiscence • •Elektroluminiscence •Termoluminiscence, Radioluminiscence, Katodoluminiscence, Triboluminiscence Excitace vyžaduje zdroj světla Excitace bez zdroje světla ‹#› 5 •Použití luminiscence v KB •Imunoanalytické metody (s fluorescenčním markerem) •Fotoluminiscenční metody (fluorescenční metody) •Chromatografické metody (s fluorescenčním detektorem) ‹#› 6 •Stanovované analyty Porfyriny Hormony Tumorové markery Kostní markery Srdeční markery Vitaminy Léky Prokalcitonin,… Výhody: vysoká citlivost ‹#› 7 • Iprutokova3 ‹#› 8 • Fotoluminiscence •Fluorimetrie •FPIA •MEIA •DELFIA • ‹#› 9 Fotoluminiscence •Podle dosvitu sekundárního záření dělíme fotoluminiscenci na: • fluorescenci (10-9 -10-5 s ) • fosforescenci (10-2 s až dny) •Absorbce primárního záření v oblasti gama, rentgenového,ultrafialového nebo viditelného spektra • Fluorimetrie – absorbce UV záření • ‹#› 10 Princip •1. Absorbce energie (excitace fotonem) - atomy nebo molekuly přechází do vyšší kvantové hladiny •2. Vyzáření (emise) energie formou luminiscence při návratu do základního stavu •3. Luminiscenční záření má větší vlnovou délku než záření excitační • (část absorbované energie je spotřebována přestavbami molekuly, fotochemickými reakcemi, tvorbou tepla, reakcí molekuly s okolím,…) • Rozdíl od rozptylu světla kdy nedochází k absorbci energie ‹#› 11 Fotoluminiscence Excitační záření Molekula v základním stavu Molekula v excitovaném stavu Molekula v základním stavu + Fluorescence Zjednodušeně: je to děj, při kterém záření o kratší vlnové délce vyvolává v látce určitého složení vznik záření o delší vlnové délce ‹#› 12 X + h.ν à X* à X + h.ν´ hν > hν´ potom Λ < Λ´ excitace emise Princip Stokesův posun je rozdíl mezi vlnovou délkou excitačního (primárního) a emitovaného (sekundárního) záření ‹#› 13 E = h.ν = (h.c)/λ E (energie fotonu) h (Planckova konstanta = 6,6262.10-34 J.s) ν (frekvence) c (rychlost světla ve vakuu 3.1010 m/s) Λ (vlnová délka) ‹#› 14 Princip (Vnitřní konverze) (Mezisystémový přechod) FLUORESCENCE FOSFORESCENCE ABSORBCE Singletový základní stav Tripletový stav Excitované singletové stavy ‹#› 15 Veličiny fluorescence •Kvantový výtěžek • poměr počtu vyzářených kvant fluorescence k počtu pohlcených fotonů •Doba života • doba mezi pohlcením kvanta budícího záření a vyzářením kvanta fluorescence •Polarizace (anizotropie) • může dát informaci o pohyblivosti molekuly fluorescenční látky v daném prostředí ‹#› 16 Přístrojová technika •Zdroj exitačního záření (Hg výbojka, halogenové výbojky, Xe výbojka, lasery). •Filtr (Woodův fitr skla s příměsí NiO, CuO, CoO). •Měřicí prostor •Interferenční filtr propouštějící fluorescenční signál. •Detektor • ‹#› 17 Schéma fluorimetru • Fluorimetr ‹#› 18 ☼ Mexcit Vzorek Memis D Schéma fluorimetru excitační zdroj monochromátorexcitačního záření kyveta se vzorkem monochromátoremitovaného záření detektor ‹#› 19 Fluorofory = molekuly nebo jejich části, které fluoreskují •Přirozené - Aromatické aminokyseliny (v bílkovinách), např. tryptofan - NADH, riboflavin, FAD, porfyriny,… •Analytické (fluorescenční značky nebo sondy) ‹#› 20 FPIA Fluorescenční polarizační imunoanalýza Fluorescence Polarization Immunoassay •K excitaci používá polarizované světlo •Homogenní kompetitivní immunoanalýza (soutěží stanovovaný analyt a analyt značený fluoresceinem o vazebná místa na specifické protilátce) •Využívá různé rychlosti rotace velkých a malých molekul (imunokomplexu a antigenu), které vedou ke změně polarizace •Fluorescence vyvolaná lineárně polarizovaným světlem je také lineárně polarizovaná ‹#› 21 •Nutná podmínka: • •Významný rozdíl v rychlosti rotace malé molekuly antigenu a velké molekuly imunokomplexu •Použití pouze pro stanovení koncentrace malých antigenů (např. léků,…) • ‹#› 22 •Malé molekuly (stanovovaný analyt a značený analyt) se otáčejí velkou rychlostí, po excitaci polarizovaným světlem značený analyt emituje fluorescenční záření do mnoha směrů.Při detekci polarizovaného světla se naměří pouze nízká intenzita tohoto záření •Je-li značený analyt vázán na na protilátku, (imunokomplex: značený antigen-protilátka), dojde ke snížení rychlosti rotace této velké molekuly, emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující – při detekci se naměří vysoká intenzita záření •Čím vyšší koncentrace stanovovaného analytu, tím více bude tohoto analytu navázáno na protilátku a tedy tím méně značeného analytu, takže naměřené hodnoty fluorescence budou nízké a naopak při nízké koncentraci naměříme hodnoty vysoké. Platí nepřímá úměra. ‹#› 23 Příklad kalibrační křivky stanovení amphetaminu ‹#› 24 •Je-li fluorofor vázán na velkou molekulu (komplex značený antigen-protilátka), nemůže volně rotovat a emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující – polarizace zůstane zachována • •Volný fluorofor může volně rotovat, emitované světlo kmitá v jiné rovině než excitující – polarizace se zeslabuje ‹#› 25 FPIA Nízká koncentrace analytu ... vzorek značka/tracer + + Vysoká polarizace = + protilátka ‹#› 26 Vysoká koncentrace analytu ... vzorek značka/tracer + + Nízká polarizace = + protilátka ‹#› 27 AxSYM(Abbott) •FPIA •MEIA •ION CAPTURE •REA AxSYM AxSYM2 ‹#› 28 •Použití lineárně polarizovaného světla (l = 485 nm - zdroj wolframová lampa + polarizační filtr) •Při návratu molekuly fluoroforu do základní stavu emise zeleného světla při 525-550 nm. •Přes polarizační filtr detekce fotonásobičem. •Měření ve dvou polarizačních rovinách vektikální a horizontální poskytne výslednou intenzitu polarizovaného světla, která je nepřímo úměrná koncentraci stanovovaného antigenu ‹#› 29 •Soutěž molekul látky ve vzorku a téže látky značené fluoroforem o vazebná místa protilátky •Marker (fluorofor) po ozáření polarizovaným světlem emituje polarizované světlo •Polarizace je nepřímo úměrná rychlosti rotace molekuly •Rychlost rotace molekuly v kapalině je nepřímo úměrná velikosti molekuly. • ‹#› 30 MEIA Enzymová imunoanalýza na mikročásticích Microparticle Enzyme Immunoassay •Heterogenní enzymová imunoanalýza na mikročásticích •Imunokomplex značený enzymem ( ALP) •Fluorogenní substrát (MUP, 4-metylumbelliferylfosfát) reaguje s enzymem (ALP) •Defosforylace substrátu (MUP MU) • (4-metylumbelliferon), luminiscence ‹#› 31 Defosforylace substrátu •MUP MU + P + luminiscence •4-metylumbelliferyl fosfát 4-metylumbelliferon + fosfát • + luminiscence ALP Světelný zdroj: Hg-výbojka (365 nm) MU emituje fluorescenční záření(448 nm) ‹#› 32 • • • Inkubace vzorku a mikročástic s navázanou protilátkou Část reakční směsi je přenesena na matrici se skleněnými vlákny Dále je přidána protilátka značená ALP Po promytí je přidán substrát (MUP), po reakci se měří intenzita fluorescence a b c d ‹#› 33 • Dissociation-enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay • Protilátky nebo antigeny jsou značeny cheláty lanthanidů: Eu (europia), Sm (samaria) a Tb (terbia) DELFIA DELFIA ‹#› 34 • •Cheláty lanthanoidů vykazují po své přeměně na sloučeninu se silnou fluorescencí velký Stokesův posun a delší dobu fluorescence. •Nekompetitivní nebo kompetitivní sendvičová technika chráněná patentem. •Detekce záření ( 620 nm)se zpožděním (odstranění interferujícího záření) •Pulzní zdroj (340nm, frekvence tisíce pulzů/s) •Opakované měření (1000 a vícekrát) • ‹#› 35 •Kongenitální hypotyreóza (SKH) • Snížená funkce štítné žlázy vede ke zvýšení koncentrace TSH •Kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) • Defekt steroidogeneze v kůře nadledvin; • nejčastěji deficit enzymu P450c21 (21-hydroxylázy) • zvýšení koncentrace 17 OHP (17-0H-progesteronu) • •Fenylketonurie/hyperfenylalaninémie Využití: „Celoplošný laboratorní novorozenecký screening“ ‹#› 36 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 029 Terčíky s krevní skvrnou jsou vkládány do jamek ‹#› 37 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 033 Naplnění jamek činidly ‹#› 38 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 039 Odstraněí terčíků z jamek ‹#› 39 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 040 ‹#› 40 GCMS_SKH_AAK_Labsklo_centrifugy 041 Fluorimetr s mikrotitrační destičkou ‹#› 41 Detektor ‹#› 42 • Chemiluminiscence •CMIA •ECLIA • • ‹#› 43 •Chemiluminiscence - je vyvolána energií chemické reakce. •Termoluminiscence – je vyvolána teplem, teploty až 500 oC •Elektrochemiluminiscence • modifikace chemiluminiscence, luminiscence je generována chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky (oxidace na anodě) • ‹#› 44 Chemiluminiscence Molekula v základním stavu Molekula v excitovaném stavu Molekula v základním stavu + Luminiscence Chemická reakce A + B à X* à P + hν Vzniká vyzářením fotonu z molekuly luminoforu po jeho chemické oxidaci působením oxidantů (H2O2, O2,…) ‹#› 45 Analytické luminofory • Luminol, isoluminol • Fluorescein • Methylumbelliferon (MU) • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Cheláty lanthanidů (Europium) Nejčastěji jsou navázány jako značka (na protilátky nebo antigeny) nebo jsou použity jako substrát. ‹#› 46 Luminol •2H2O2 = 2 H2O + O2 (Peroxidáza) • •Luminol + 2H2O +O2 ®Aminoftalát +N2 +3H2O+ světlo ‹#› 47 Chemiflex™ (Abbott) Patentovaný ester akridinu Akridinium(N-sulfonyl)karboxamid Sloučenina je velmi stálá Reakce: - oxidace v kyselém prostředí (pH=2; HNO3 a H2O2) - změna prostředí na zásadité (NaOH) - vznik nestabilní N-sulfonylpropylakridon v excitovaném stavu - při přechodu do stabilní formy se uvolní CO2 a energie v podobě světla (430nm) f ‹#› 48 CMIA Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích •Heterogenní imunoanalýza - separace pevnou fází •Paramagnetické mikročástice •Emise světla molekulou, která je produktem chemické reakce • •Systém není ozařován zdrojem světla. ‹#› 49 •I. Vzorek se přidá k paramagnetickým mikročásticím potaženými specifickou protilátkou. Analyt ze vzorku se naváže na mikročástice. •II. Po promytí se přidá konjugát protilátek proti stanovovanému analytu s luminoforem. •III. Do reakční směsi se přidají roztoky H202 (Pre-Trigger) a NaOH (Trigger) •IV. Změří se výsledná luminiscence • (v RLU jednotkách) ‹#› 50 •Intenzita záření odpovídá počtu chemiluminiscenčních molekul • (1 molekula = 1 kvantum světla) •Reakční postupy mohou být jedno nebo dvou stupňové •Kompetitivní uspořádání ‹#› 51 Lumigen® (Siemens) Fosfátový ester adamantyl dioxetanu Reakce: - defosforylace substrátu účinkem ALP - vznik nestabilního meziproduktu v excitovaném stavu - při jeho tvorbě je emitován tok fotonů/ luminiscence ‹#› 52 • modifikace chemiluminiscence, světlo je generováno chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky ECLIA Elektrochemiluminiscence Elecsys 2010 ‹#› 53 ECLIA • Elektrochemiluminiscence ‹#› 54 •Na platinové elektrodě je chelát Ru2+ oxidován na Ru3+, •Zároveň je tripropylamin (TPA+) oxidován na radikál TPA+ (má redukční vlastnosti), proto snadno redukuje Ru3+komplex na Ru2+, •Elektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny Ru-kationtu, přechodem elektronu do základního stavu dojde k luminiscenci a Ru-komplex je opět schopen další oxidace •