Vyšetřovací metody v molekulární biologii MUDr. Dana Bučková, Ph.D. Oddělení klinické biochemie FN Brno 297px-DNA_replication_split_svg Molekulární biologie •vědní disciplína zabývající se studiem buněčných biologických procesů na jejich molekulární úrovni •věnuje se popisu biologických makromolekul a jejich vzájemným funkčním vztahům •pozornost je především věnována funkci makromolekul podílejících se na dědičnosti organizmů, tedy DNA, RNA a proteinům: • DNA → RNA → protein •integruje ve svém přístupu hlediska biologická, chemická, fyzikální i genetická Image1 5% DNA Využití molekulárně biologických metod •genetika - detekce dědičných chorob (fenylketonurie, cystická fibróza aj.) •farmakogenetika (glukóza-6-fosfát dehydrogenáza, N-acetyltransferáza) •genetické inženýrství - konstrukce genotypů metodami molekulární biochemie •přímý průkaz patogenních mikroorganizmů (CMV, HBV, HCV, borrelie atd.) •kriminalistika (identifikace pachatelů i obětí) •výzkum (hledání zodpovědných genů) Metody •izolace DNA (RNA) •amplifikace pomocí PCR •RFLP - identifikace polymorfizmů •mapování a sekvenování genomu •genová exprese mRNA •Real-time RT-PCR •hybridizační techniky Dna-split Izolace DNA dle Sambrooka (1989) •5ml venózní krve do 0,3 ml 0,5M EDTA, + dest. voda (do 20 ml), zmražení na -20°C min na 48 hod •rozmražení ve vlažné vodě cca 20 min, centrifugace 10 min při 5000(4°C), opak. promytí dest. vodou a fyziolog. roztokem, opět centrifugace 10 min při 5000(4°C), k promytému sedimentu 0,5 ml fyziolog. roztoku, přidá se FASANO (5M NaCl, 0,5M EDTA, 1M TRIS, 10% sodium dodecylsulfát) a 20 µg proteinázy K, inkubace při 37°C do druhého dne, •1,4 ml 5M NaCl a 1,4 ml chloroformu, centrifugace 15 min při 8000(4°C), horní vrstva se odpipetuje a přidá se k ní 4 ml ledového izopropylalkoholu •vysrážená vlákna DNA se namotají na skleněný háček, opláchnou 70% etanolem a osuší 5 min na vzduchu, pak se rozpustí ve 250 µl TE pufru a nechá se 24 hod při pokojové teplotě za občasného míchání •zásobní roztok DNA se uchovává při teplotě -20°C QuickGene – 810 (FUJIFILM) •systém pro izolaci DNA/RNA •vysoká výtěžnost, reprodukovatelnost a bezkonkurenční čas trvání izolace •vysoká kvalita a čistota, quickgene-810 • vhodná pro PCR a kvantitativní real-time PCR, blotování, SNP, genotypizaci, sekvenování, klonování… ….cena 280.000 bez DPH + kity Izolace Izolace1 PCR (polymerase chain reaction) •umožňuje zmnožit (amplifikovat) zvolený úsek DNA teoreticky i z jedné molekuly na měřitelné jednotky (ng a µg) •namnožit úsek DNA můžeme jen tehdy, když známe pořadí nukleotidů na obou koncích tohoto úseku ® primery (20-30 bazí) •byla užita Taq polymeráza, izolovaná z druhu bakterie Thermus aquaticus (teplé prameny v Yellow-stone National Park) a její teplotní optimum je 72 °C, dnes se běžně užívá rekombinantní Taq polymeráza Master mix •umožňuje provádění PCR •musí obsahovat pufr, nukleotidy (dNTP), primery, polymerázu a H2O (pro PCR), Mg2+ •DNA pak doplníme do každé zkumavky zvlášť •mikrozkumavka PCR 0,2 ml s víčkem 853 12691_ms bioplastic-slide Průběh PCR •1. krok: DENATURACE (denaturation) • - při 94-95°C, 15 sec až 1 min •2. krok: VAZBA PRIMERŮ (anealing) • - obvykle 50-65°C, desítky sec až minuta •3. krok: AMPLIFIKACE (extension) • - obvykle 70-74°C, malé 20-45 sec, velké (desítky kb) až 15 min • •Přístroje thermocycler (termocykler, cykler) již od 99.000 bez DPH gradient-thermal-cycler-multigene1 T1Thermocycler_bearbeitet__2006__web 201045 732-1832 PE9600 -174C/G polymorfizmus v IL-6 •9,4 µl H2O pro PCR •1,5 µl Tris-HCl pufru •1,5 µl MgCl2 •0,6 µl od každého primeru (P1, P2) •0,3 µl dNTP •0,1 µl Taq polymerázy •2,0 µl DNA •Celkový objem 16 µl • •denaturace DNA 95°C/2min •35 cyklů: denaturace 94°C/45s, anealing 55°C/25s, extenze 72°C/45s •finální extenze 72°C/5min •chlazení 12691_ms 4310 Image3 Image2 pierce_18_19_large_2 1060 edvocycler-thermal-cycler siteimages%2Ftechne%2FThermal_Cycler_TC_Plus_open_cycler images%5Clisting%5CRoboCycler1 imagessupp_1_645 T3000 28316 26812_a hottop 194_TC-3000G 420x420 220px-Cycler_offen bt0906eppendorfec Alelicky specifická PCR •detekce bodových mutací, malých delecí •alelicky specifické oligonukleotidy •3 primery, 2 alternativní verze jednoho konce (mutovaná/nemutovaná), druhý konec stabilní •mutace je kryta • primerem • PAI_popis Analýza PCR produktu •Hybridizace •Sekvenování •RFLP • (Restriction Fragment Length Polymorphism) •RT-PCR (Real Time RT-PCR) • RNA => cDNA Cobas Amplicor® •provádí amplifikace a detekce v jednom integrovaném systému •výsledky k dispozici během 4 - 6 hodin •HCV, HBV, HIV, CMV, C.trachomatis, N.gonorrhoeae, M.tuberculosis •Interní kontrola eliminuje •falešně negativní výsledky cobas_amplicor_page Hybridizační techniky •spojování dvou jednořetězcových molekul nukleových kyselin za tvorby hybridu: • DNA x DNA, DNA x RNA, RNA x RNA •obě vlákna jsou v roztoku nebo je jedna hybridizující složka vázána na nosič •hybridizace NK zakotvených na filtrech (nitrocelulózové a nylonové) se značenou sondou •sondu označujeme molekulu nukleové kyseliny, kterou použijeme k vyhledání určité sekvence ve vzorku testované DNA nebo RNA • f3b9f830af_71221171_o2 Kvantitativní PCR v reálném čase •sondy označené fluorescenčním barvivem •hybridizují s templátovou DNA za stejných podmínek jako primery (v oblasti mezi nimi) •DNA-polymeráza má také exonukleázovou aktivitu - odbourává nasedlou sondu •schopnost fluorescence až po uvolnění do roztoku - v průběhu PCR je ozařován vzorek excitačním zářením, které vybudí fluorescenci uvolněného barviva •reverzní transkripce - PCR (Real-time RT PCR) - přesné množství vstupní templátové DNA RT-PCR real-time-koncept Real-time RT PCR Minimální reziduální choroba (MRD) •přítomnost metastáz u pacienta s nádorovým onemocněním •zobrazovací techniky (např. CT, magnetická rezonance, ultrazvuk) a mikroskopické metody nemají dostatečnou citlivost •detekce izolovaných nádorových buněk v krvi, kostní dřeni či v lymfatickém systému •pod limitem standardních vyšetřovacích metod (imunohistochemie, průtoková cytometrie aj.) ® Real-time RT PCR Sekvenování (sekvenace, sekvencování) •zjišťuje pořadí nukleových bází (A, C, G, T) v sekvencích DNA (jádro, mitochondrie, plazmidy) •od 70. let 20. století je používána metoda Fredericka Sangera, která využívá dideoxynukleotidů a následné elektroforézy •projekt čtení lidského genomu 800px-Sanger_sequencing_read_display 0c0e397a94_71196986_o2 Sangerova metoda •sekvence, primer, DNA polymerázu, dNTP, jeden ze čtyř dideoxynukleotidů •začlení se do replikující se DNA, ale zastaví elongaci řetězce - nemá OH skupinu •každý dideoxynukleotid se vloží do jedné ze čtyř nádob Sequencing Sanger_sequencing_read_display Maxam-Gilbertova metoda •DNA na 5' konci radioaktivně označena fosforem •vystavena chemikáliím, které specificky štípají sekvenci DNA v místě, kde rozpoznají jistou nukleovou bázi •do polyakrylamidového gelu a spustí se elektroforéza •sekvence DNA je GTCATAGCA (čte se zespodu) GTCATAGCA_in_maxam_gilbert_sequencing Pyrosekvenování •novější metoda, vznikla v roce 1996 •mimo DNA polymerázy ještě ATP sulfuryláza, luciferáza a apyráza, adenosinfosfosulfát a luciferin •postupně vkládány nukleotidy různých typů (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – přidáním se z uvolní světelné záření… uvolnění pyrofosfátu z nukleotidu a spotřeba vzniklého ATP luciferázou k oxidaci luciferinu Pyrogram1 A051011_KUZ_SEKVENATOR_V 130886156199927 Sekvenator - ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer obr08 RFLP (délkový polymorfizmus restrikčních fragmentů) •bakteriálních endonukleázy („restriktázy“), které štěpí DNA, v přesně definované sekvenci nukleotidů, např. bakterie Escherichia coli - enzym s názvem EcoRI 800px-1QPS Stepeni%20EcoRI Restrikční endonukleázy •přirozeně se vyskytují v bakteriích •chrání je před infikujícími bakteriofágy •enzym „rozstříhá“ DNA fága, když vnikne do buňky •bakteriální DNA je chráněna metylací sekvencí, které enzym rozeznává •typicky rozeznávají úseky o 4-6 bp •známe asi 300-400 různých endonukleáz Southernův blotting •základní princip metody: •štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz •elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky •přenos fragmentů na membránu (nylon, nitrocelulóza) •denaturace DNA •hybridizace se značenou sondou •rtg film, expozice • dobrý Northern_Blot_Scheme Restrikční analýza -573G/C v IL-6 •PCR produkt 543bp 12 µl •voda 2,7 µl •pufr 2,0 µl •BsrBI 0,3 µl •inkubace při 37°C po dobu 4 hod •výsledné fragmenty: 274 a 269 bp (G alela) • 543 bp (C alela) •ELFO ve 2% agarózovém gelu LDL Elektroforéza fragmentů DNA •vkládací pufry - roztoky o vysoké hustotě usnadní vkládání vzorků DNA do jamek •manipulaci se vzorky umožní barviva - pohyblivost při elfo jako DNA (např. bromofenolová modř) •záporný náboj - pohybují v elektrickém poli od katody k anodě •vizualizace pomocí ethidium bromidu popř. jiných barviv (SYBRGreenu, GelGreen a GelRed) elektroforeza elfo1 UV transluminátor uv-transiluminatory Gelp Gel CD14 X13 -35 37- 58 dle seznamu C(-159)Tbarva s popisem IL-6MnlQD1,5,7,9,11,14,PH34,39,47,52 1145A-G Bez názvu Vyhledávání mutací •SSCP (single strand conformation polymorphism, polymorfismus konformace jednořetězcové DNA) •elektroforéza jednovláknové DNA na polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě - rychlost, jakou putuje během elektroforézy, závisí na přesné konformaci •odliší často i záměnu jediné báze Děkuji za pozornost 320950597 Thermal-Cycler-Validation