FAGOCYTÓZA II Mgr. Olga Tichá, LF MU Glu-6-P HCO3- HMP zkrat NADP + 2H+ NADPH + H+ NADPH oxidáza O2 O2- + O2- + 2H+ Fe3+ /Fe2+ superoxiddismutáza OH. H2O2 (Haber-Weiss) myeloperoxidáza +SCN- +Cl- +RH HOCl HOSCN + H2O2 + O2- R. + R-NH2 1O2 R-NHCl OH. •FAGOCYTUJÍCÍ BUŇKY neutrofil eosinofil basofil monocyt makrofág dendritická b. 70px-Neutrophil 70px-Eosinophil2 70px-Basophil 70px-Monocyte 70px-Macrophage 70px-Dendritic_cell V periferii je cca 7% celkového množství fagocytů, zbytek je v kostní dřeni, odkud se průběžně vyplavují a zároveň doplňují. KREVNÍ DIFERENCIÁL • využití průtokové cytometrie • s mAb nebo bez nich • granulocyty tvoří 40-65% všech leukocytů parfirení krve • PRŮBĚH FAGOCYTÓZY •ADHEZE („rolling“) → cytometrie – exprese LAD1, LAD2 •EXTRAVAZACE A DIAPEDÉZA •ROZPOZNÁNÍ OPONIZOVANÝCH ČÁSTIC •CHEMOTAXE → test migrace pod agarózou •INGESCE → fagocytóza mikroorganismů nebo inertních částic •DIGESCE - mechanismus nezávislý na kyslíku → mikrobicidní test, detekce enzymů - mechanismus závislý na kyslíku → mikrobicidní test, NBT, INT, detekce myeloperoxidázy, chemiluminiscenční test, „burst“ test ROZPOZNÁVACÍ MECHANISMY FAGOCYTŮ Fagocyty jsou schopné rozpoznat struktury, které se nacházejí na povrchu mikroorganismů, ale ne na buňkách vlastních. Tyto struktury jsou evolučně konzervované, sdílené různými mikroorganismy a nezbytné pro jejich život. Příklady: • LPS (G-bakterie), peptidoglykany (G+ bakterie), glukany a manany (kvasinky a plísně) • • Opsoniny – komplementové fragmenty (C3b), protilátky (Fc fragment) • • Fosfolipidy - na povrchu vlastních apoptotických buněk (za normálních okolností se nacházejí výhradně na vnitřní straně membrány) PRO ROZPOZNÁNÍ RŮZNÉ DRUHY RECEPTORŮ Pro rozpoznání charakteristických mikrobiálních nebo apoptotických komponent slouží fagocytům různé druhy receptorů: • manózové receptory rozeznávající cukerné struktury na povrchu bakterií a některých virů • scavengerové receptory – rozeznávají acetylované LDL • chemotaktické receptory (fMLP) • Toll-like receptory • komplementové receptory • Fc receptory •Správná funkce fagocytů je pro organismus nezbytná!!! (hlídání adekvátnost zánětlivé reakce na cizorodou částici: cizorodá vs. vlastní) •Naopak hyperaktivace fagocytů – problémy: poškození okolních buněk a tkání reaktivními metabolity a proteolytickými enzymy •Deficience ve funkcích fagocytů = těžký průběh banálních infekcí příklad: CGD (chronická granulomatóza) – defektní NADPH oxidáza (častá bakteriální a fungální onemocnění) • • KLINICKÝ VÝZNAM FAGOCYTÓZY DALŠÍ VYŠETŘENÍ FAGOCYTÓZY •MIKROBICIDNÍ TEST -sledování schopnosti fagocytů pohlcovat a usmrcovat živé kvasinky; usmrcené kvasinky se z fagocytů uvolní deoxycholátem a jejich množství se určí obarvením methylenovou modří - •NBT (INT) TEST -při aktivaci fag. vznikají kyslíkové deriváty (peroxid vodíku, superoxidový radikál) – tato aktivita je hodnocena redukcí tetrazoliových solí; -bezbarvý roztok soli proniká při fagocytóze do buňky, kde je redukován na nerozpustný barevný formazan; při extrakci měřitelný spektrofotometricky. NBT = nitrobluetetrazolium INT = iodonitrotetrazolium •Kvantitativní test pro vyhodnocení oxidačního vzplanutí u granulocytů a monocytů •Fagocytující buňky se stimulují E. coli, fMLP a PMA (3 různé zkumavky)-dochází k oxidačnímu vzplanutí •Ke vzorkům přidán DHR (dihydrorhodamin 123), který je radikály oxidován na zeleně fluoreskující rhodamin 123 •Na průt. cytometru sledován počet (procento) zeleně fluoreskujících granulocytů a monocytů • Burst test I. Burst test II. •Inkubace vyšetřované heparinizované krve při 37oC za přítomnosti dihydrorhodaminu 123 • •Stimulans: A) (opsonizované) E.coli B) PMA C) fMLP •Výsledek: •1. % aktivních fagocytujících buněk: Normální hodnoty: A) (opsonizované) E.coli: 80-100% B) PMA : 90-100% •2. Stimulační index: mean intenzity fluorescence stimulovaných buněk SI = ---------------------------------------------------------------- mean intenzity fluorescence nestimulovaných buněk Normální hodnoty: A) opsonizované E.coli: 30 a více B) PMA : 30 a více CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA ZDRAVÁ KONTROLA STIMULACE PMA 97% PACIENT STIMULACE PMA: 12% BEZ STIMULACE STIMULACE PMA ZDRAVÁ KONTROLA PACIENT S CGD STIMULACE E.Coli CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA (AUTOZOMÁLNĚ RECESIVNÍ) CHRONICKÁ GRANULOMATÓZA (X-VÁZANÁ)