IMUNOESEJE



IMUNOESEJE
•
•tyto metody využívají vazebné reakce mezi protilátkou a ligandem (antigenem), informace o vazbě je
zprostředkována pomocí značek
•množství značené komponenty v imunokomplexu je závislé na koncentracích výchozích neznačených
komponent.

PŘÍMÉ
NEPŘÍMÉ
KOMPETITIVNÍ
NEKOMPETITIVNÍ
HOMOGENNÍ
NEHOMOGENNÍ

•Přímé
-kvalitativní metodika k průkazu antigenu
-Ag – Ab*
•
•
•Nepřímé
•- průkaz protilátek v séru
•- Ag – Ab – Ab*

•Kompetitivní
-limitované množství reaktantu (protilátka), aby mohlo docházet ke kompetici
-značený i neznačený ligand soutěží o vazebná místa protilátky
-neznačený antigen blokuje vazbu značeného antigenu, množství vzniklého produktu je nepřímo úm.
konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku
-čím víc se naváže značeného ligandu, tím méně neznačeného
-
•
•
•
•
•Nekompetitvní (sendvičová)
-protilátka je v nadbytku, všechen analyt je vyvázán
-analyt je vázán mezi dvěma specifickými protilátkami
-množství vzniklého produktu je přímo úm. konc. neznačeného ligandu v testovaném vzorku
-
•
http://imunologie.lf2.cuni.cz/soubory_vyuka/imunoreakce.pdf

•Homogenní
•- není potřeba oddělovat Ab-Ag od volného Ag*
•
•Heterogenní
•- jedna z komponent je navázána na pevnou fázi
•- nutnost separace navázaných složek reakce od volných složek reakce (detekční protilátka,
konjugát)
http://www.scielo.br/img/revistas/bjce/v26n2/a01fig01.jpg

IMUNOESEJE
ENZYM
vizualizace sekundární fáze interakce AgxAb navázanou značkou:
RADIOIZOTOP
FLUOROCHROM
LUMINOFOR

RIA
-kompetitvní heterogenní metoda
-oddělení nukleární medicíny
•
-detekce reakce Ag-Ab pomocí radioaktivního izotopu jako značky navázané na jednu ze složek reakce
, nejčastěji 125I
-měří se intenzita radioaktivního zářiče – není třeba přidávat substrát
•
-vyšetřování hladin různých hormonů a jejich metabolitů, vitamínů a jejich metabolitů, specifického
IgE, některých autoprotilátek – např. vyšetření Ab proti acetylcholinovému rec. při myastenia
gravis
•

•FIA – jako značka se používá molekula fluorochromu, detekce signálu se provádí fluorimetricky
•
•LIA – značka – luminofory (při oxidaci vyzařují světlo), detekce na luminometru
•
př. bioluminiscence - oxidace luciferinu (enzym luciferáza)
                 oxyluciferin a světlo
světélkování světlušek
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=0F9857EB-03B8-09C9-42AE-63226C2FDFCA

EIA
•kovalentní vazba enzymu na některý z reaktantů
•heterogenní uspořádání – skupina metod ELISA
•       (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
•

ELISA-schéma



http://virus.usal.es/web/demo_microali/enterotoxina/set.html
1.Potažení jamek antigenem
2.Přidání vzorku séra
3.Přídání enzymem značené protilátky(anti-human IgG)
4.Přidání substrátu
5.Odečtení barevné reakce
1
2
3
4

EIA-ELISA I
•1 reaktant imobilizován na povrch destičky
•detekovaný antigen musí mít 2 různé epitopy
•výsledkem je přeměna bezbarvého substrátu na barevný rozpustný produkt – tato přeměna pomocí
enzymu na Ab
•čím ↑ intenzita zbarvení, tím ↑ koncentrace zjišťovaného Ag ve vzorku
•zabarvení se zjišťuje spektrofotometricky

EIA-ELISA II
•nejen kvalitativní, ale i kvantitativní metoda
•lze stanovovat Ab i Ag (pozor na pojmy!!)
•k průkazu látek s nízkou koncentrací ve vyšetřovaných vzorcích v mikrobiologické serologii a
imunologii:
•
specifických Ab
•Antivirových
•Antibakteriálních
•Autoprotilátek
•
nebo Ag

• 4. Ab s enzymem – křenová peroxidáza, alkalická fosfatáza, beta galaktozidáza,…
• 5. substrát – např. tetrametylbenzidin
 6. barevný výsledek
7. hodnocení…kalibrace, cut-off limity
1.“kautování“
prázdná jamka
Ag
polystyrén
Ab
…následuje 2.blokování, 3. nanesení vzorků, atd…

ELISA reader