IMUNOFLUORESCENCE MUDr. Zita Trávníčková Ústav klinické imunologie a alergologie FN USA a LF MU Brno 7.4.2008 Základní pojmy lLUMINISCENCE –Jev, kdy látka vysílá do prostoru světlo l lpři chemické reakci → CHEMILUMINISCENCE l lpo osvětlení zářením → FLUORESCENCE l → FOSFORESCENCE LUMINISCENCE po osvětlení zářením l l lZáření EXCITAČNÍ lzáření vyvolávající luminiscenci l l lZáření EMISNÍ lzáření vysílané látkou LUMINISCENCE po osvětlení zářením lFLUORESCENCE lvyzařování emisního světla trvá krátkou dobu lpo zhasnutí excitačního záření téměř okamžitě emise zhasíná (asi za 10-8 sekundy) vLátka schopná fluorescence → FLUOROCHROM lFOSFORESCENCE lvyzařování emisního světla trvá i dlouhou dobu po zhasnutí excitačního záření l l Fyzikální podstata fluorescence a fosforescence lspočívá ve vlastnostech elektronového obalu atomů v molekulách fluorochromu vAbsorpce fotonu excitačního světla → zvýšení jejich energie vVyzáření části nově nabyté energie jako foton s nižší energií → tedy delší vlnovou délkou vStokeovo pravidlo - v důsledku ztráty energie je vlnová délka emisního světla vždy delší než světla excitačního → POSUN EMISNÍHO SVĚTLA K ČERVENÉ ČÁSTI SPEKTRA v IMUNOFLUORESCENCE lPatří mezi IMUNOESEJE l limunokomplex ANTIGEN - PROTILÁTKA l+ enzym ENZYMOVÁ ANALÝZA l+ radioaktivní zářič RIA l+ fluorochrom IMUNOFLUORESCENCE l TYPY imunofluorescence l lPŘÍMÁ l lZnačení buněčných struktur pomocí konjugátu ØProtilátka namířená proti určité buněčné stuktuře kovaletně navázaná s fluorochromem l l lNEPŘÍMÁ l lZnačení buněčné struktury pomocí primární zvířecí protilátky proti buněčné struktuře lZviditelnění buněčné struktury v druhém kroku pomocí konjugátu fluoresceinu s protilátkou proti zvířecím antigenům TYPY imunofluorescence lPŘÍMÁ l l l lNEPŘÍMÁ l l l l l l l PŘÍMÁ imunofluorescence lJednostupňový průkaz antigenu l1 vzorek (buněčná kultura, tkáň, …) l2 fixace (vzorku na podložní sklo) l3 konjugát (protilátka proti antigenu s navázaným fluorochromem) l4 proplach l5 fluorescenční mikroskop Přímá IF - využití lPrůkaz antigenu v tkáňových řezech nebo dalších biologických vzorcích –rychlý průkaz patogenů ve sputu nebo bronchoalveolární laváži l Nepřímá imunofluorescence lPrůkaz protilátek v séru l1 vzorek (substrát s antigenem) l2 fixace (vzorku na podložní sklíčko) l3 přelití vyšetřovaným sérem pacienta l4 proplach l5 konjugát (antisérum proti lidským Ig s navázaným fluorochromem) l6 proplach l7 fluorescenční mikroskop Nepřímá IF - využití lPrůkaz specifických protilátek proti antigenům lNejčastěji průkaz autoprotilátek –orgánově nespecifických (antinukleárních, antimitochondriálních, antiendomysiálních) –orgánově specifických (proti parietálním buňkám žaludku, beta buňkám pankreatu, bazální membráně glomerulů, slinným žlázám, nadledvinám, ... Některé používané FLUOROCHROMY lFITC (fluorescein isothiokyanát) lHoechst (bisbenzimid) lDAPI lEthidium bromid l lPropidium Jodid lAcridinová oranž lCongo Red l l l Øširoce používané l ØDNA ØDNA a RNA ØDvouřetězcová DNA a RNA ØDNA ØDNA a RNA Øamyloid l l l l Vizualizace imunofluorescence lPomocí fluorescenčního mikroskopu l lTYPY fluorescenčních mikroskopů –transmisní –epifluorescenční lZDROJ SVĚTLA –rtuťová výbojka l l Princip IF mikroskopu lEXCITAČNÍ filtr –propouští z barevného spektra pouze část potřebnou pro excitaci fluorescence a zabraňuje průchodu světla o stejné či podobné vlnové délce jako světlo emisní, které by vytvářelo pozadí lBARIÉROVÝ filtr –propouští pouze emisní část spektra a zabraňuje průchodu excitačnímu světlu Princip IF mikroskopu filtry.jpg Excitační (modrá) a emisní (zelená) spektrum fluorochromu FITC a spektra propouštěná excitačním a bariérovým filtrem (bílá čára). graf Typy imunofluorescence l lHOMOGENNÍ lOKRAJOVÝ lSKVRNITÝ lNUKLEOLÁRNÍ (homogenní, chomáčkovitý skvrnitý) lTEČKOVANÝ lCYTOPLAZMATICKÝ Negativní l l vysec_IMG_0229 Negativní IMG_0018 Homogenní IMG_0047 Nukleolární IMG_0008a Granulární (+ mitotický aparát) IMG_0041 AMA AMA_0052 Mitochondrie Nukleolární homogenní Mnohočetné jaderné tečky Přehled vyšetření pomocí IF lANCA - cytoplazma neutrofilů lDNA - ds DNA lENA - extrahovatelné nukleární antigeny lAMA - mitochondrie lANA = ANF = antinukleární faktor (antigen) lRET – Ab proti retikulinu (IgA a IgG) lASMA – Ab proti hladkému svalu lGPC – Ab proti parietálním buňkám žaludku lEMA – antiendomysiální protilátky DĚKUJI ZA POZORNOST