Elektroforetické metody
Petr Breinek
Logo MU.jpg
Elektroforéza-I 2012

Elektroforéza je analytická metoda založená na rozdílné pohyblivosti nabitých částic v elektrickém
poli v tekutém mediu.
Pohyblivost částic závisí na:
• velikosti náboje
• velikosti a tvaru částice
• hmotnosti částice
• vlastnostech prostředí

Bílkoviny: elektrický náboj
Elfo náboj bílkovin.jpg
Při pH = 8,6 putují bílkoviny od katody (-) k anodě (+)

1.Volná (Arne W. Tiselius – Nobelova cena;1948)
Vodné roztoky (elektrolyty)
Částice putují k elektrodě s opačnou polaritou
Problém: vznikající teplo,….
Rozdělení elektroforetických technik
apparatus.jpg 225px-Arne_Tiselius.jpg

1.Volná
2.Zónová na nosičích
3.
Izoelektrická fokuzace (IEF)
SDS gelová elektroforéza
Dvojrozměrná (two-dimensional, 2-DE))
Kapilární elektroforéza (CE)
Izotachoforéza
1.
Rozdělení elektroforetických technik

Nosiče
-Papír
-Acetátcelulozová folie
-Gel
Agarózový gel
Škrobový gel
PAGE - SDS
Polyakrylamidový gel (PAGE,polyacrylamide gel electrophoresis)
sítový efekt; endoosmóza,..
-
-

Postup (zjednodušeně):
-Aplikace vzorků
-Dělení
-Fixace a barvení
-Odbarvení
-Sušení
-Vyhodnocení
-pH = 8,6
Elektroforéza bílkovin v krevním séru

Automatický elektroforetický přístroj  Hydrasys (Sebia,Francie)












Vyhodnocení elektroforeogramů
image002.gif
v vizuální hodnocení
v denzitometricky
v skener
v ……..

IZOENZYMY



15 ISO LD



LIPOPROTEINY






IMMUNOFIXACE



4 IF



PAGE SDS elektroforéza
Elfo SDS PAGE.jpg
SDS = dodecylsíran sodný
Zrušení disulfidických vazeb, bílkoviny získají stejný elektrický náboj, pohyblivost závisí na
molekulové hmotnosti

PROTEINURIE



5 PROTEINURIE



•
• IEF je technika rozdělující bílkoviny podle jejich izoelektrických bodů (pI)
•
•Dělení probíhá v gelu s lineárním pH gradientem vytvořeným směsí amfolytů (100-200), každý amfolyt
má jiný izoelektrický bod
•
Izoelektrická fokuzace (IEF)

• Příklad využití IEF
•Stanovení oligoklonálních pásů IgG v likvoru
•
•Bez zahuštění likvoru
•Současně se analyzuje sérum a likvor (ve stejné koncentraci)
•Imunochemická detekce a barvení
•
•

•
• Stanovení oligoklonálních IgG pásů v likvoru a v krevním séru metodou izoelektrické fokuzace s
následným imunofixačním barvením umožňuje kvalitativní vyjádření intratekální syntézy IgG.

9 IEF a



pasy3



Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE)
üNejdříve jsou proteiny rozděleny podle svých izoelektrických bodů (IEF)
üa následně se proteiny dělí v závislosti na jejich molekulové hmotnosti  (SDS-PAGE)
Použití:
Separace
komplexních
směsí
bílkovin
(proteomika)
Až několik tisíc
 proteinových skvrn!
a.jpg

Kapilární elektroforéza
ØJe technika založená na principu elektrokinetické separace v kapiláře malého vnitřního průměru (10
až100 µm), dlouhé 20 až 200 cm; naplněné elektrolytem při vysokém napětí (7 700 V)
ØRůzné provedení (gel, IEF, volná,…)
ØVýsledkem je rychlá a velice účinná separace molekul s výborným rozlišením.
ØRoztok putuje kapilárou najednou

PRINCIP KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY
DETEKTOR
Migrace
Kontrolovaná teplota
Pufr
Pufr
Zdroj vysokého       napětí

Kladný náboj z pufru
Záporný náboj na stěně capiláry
Elektro-osmotický tok (EOT) je mnohem silnější než elektrické pole.
Ve výsledném efektu, jsou všechny bílkoviny unášeny ke katodickému konci kapiláry.
Anoda +
síla EOT
Síla electrického pole
Migrace   bílkovin
DETEKCE
NASÁTÍ VZORKU

CAPILLARYS



20