Luminiscence _ I 2012 LUMINISCENČNÍ metody Petr Breinek Luminiscence je jev, při kterém vzniká světlo (fotony) po předchozím dodání energie (excitaci) materiálu. Luminiscence je charakteristická svojí dobou trvání, která o několik řádů převyšuje doby života termálních kmitů (záření černého tělesa), t.j. tepelné záření není luminiscence! LUMINOFOR/ FLUOROFOR TEPLO SVĚTLO EMITOVANÉ záření LUMINISCENCE EXCITAČNÍ záření •Luminiscence = emise světla (fotonů) atomy a molekulami (luminofory), které se nacházejí v excitovaném stavu (elektron se vrací z excitovaného stavu nebo vyšší energetické hladiny na nižší energetickou úroveň - do základního stavu) Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscenční molekuly (Jablonského diagram) Nezářivé přechody: VR - vibrační relaxace IC - vnitřní konverze ISC - mezisystémová konverze Zářivé přechody: Fluorescence - přechod do nižšího elektronového stavu se stejnou multiplicitou S1®S0 (FL) spinově povolený přechod Fosforescence - přechod mezi stavy s různou multiplicitou T1 ®S0 (Ph) spinově zakázaný přechod E Bioluminiscence v přírodě medúza Světlušky, medúzy, dřevokazné houby, hlubokomořské ryby,…… Jellyfish Světluška princip: oxidace luciferinu luciferin Luciferin + ATP ® Luciferyl adenylát (enzym luciferáza) Luciferyl adenylát ® Oxyluciferin + AMP + CO2+ světlo Reakcí jedné molekuly luciferinu je produkován jeden foton o vlnové délce odpovídající namodralému světlu. Při reakci se pouhé 4 % energie mění na energii tepelnou a zbytek, tedy 96 % energie je vyzářen. Světluška je tedy daleko účinnější zářič než běžná výbojka, která má tento poměr 9:1 (tedy jen 10 % energie přechází na světlo). světluška Faktory ovlivňující citlivost fluorescence 1.Intenzita zdroje 2. 2.Účinnost optického systému 3. 3.Štěrbiny monochromátoru 4. 4.Citlivost detektoru 5. 5. 8 Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace ü Fotoluminiscence - absorpce energie ve formě světla ü Chemiluminiscence a bioluminiscence - zdrojem energie je chemická nebo biochemická reakce ü Elektroluminiscence – zdrojem je el. proud; Katodoluminiscence – zdrojem je proud elektronů ; Thermoluminiscence; Radioluminiscence – zdrojem je radioaktivní záření; Mechanoluminiscence – zdrojem je mechanická energie; Krystaloluminiscence – krystalizace je doprovázena luminiscencí; další zdroje •Použití luminiscence v KB •Fotoluminiscenční metody (fluorescenční metody) •Imunoanalytické metody (s fluorescenčním markerem) •Chromatografické metody (s fluorescenčním detektorem) •Stanovované analyty Porfyriny Hormony Tumorové markery Kostní markery Srdeční markery Vitamíny Léky Prokalcitonin,… Výhody: vysoká citlivost Principy fluorescenčních stanovení •1. Přímé metody • měříme přirozenou fluorescenci vzorku • •2. Nepřímé metody • nefluoreskující vzorek přeměníme na fluoreskující derivát 1. •3. Zhášecí metody • sledujeme pokles intenzity fluorescence určitého fluoroforu, která v nastává v důsledku zhášecí schopnosti vzorku Fotoluminiscence •Podle dosvitu sekundárního záření dělíme fotoluminiscenci na: • fluorescenci (10-9 -10-5 s ) • fosforescenci (10-2 s až dny) •Absorbce primárního záření v oblasti gama, rentgenového,ultrafialového nebo viditelného spektra • Fluorimetrie – absorbce UV záření • Fotoluminiscence Excitační záření Molekula v základním stavu Molekula v excitovaném stavu Molekula v základním stavu + Fluorescence Zjednodušeně: je to děj, při kterém záření o kratší vlnové délce vyvolává v látce určitého složení vznik záření o další vlnové délce X + h.ν à X* à X + h.ν´ hν > hν´ potom Λ < Λ´ excitace emise Princip E=h.c/λ E (energie fotonu) h (Planckova konstanta = 6,6262.10-34 J.s) ν (frekvence) c (rychlost světla ve vakuu 3.1010 m/s) Λ (vlnová délka) Stokesův posuv Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii Stokesův posuv l Veličiny fluorescence •Kvantový výtěžek • poměr počtu vyzářených kvant fluorescence k počtu pohlcených fotonů •Doba života • doba mezi pohlcením kvanta budícího záření a vyzářením kvanta fluorescence •Polarizace (anizotropie) • může dát informaci o pohyblivosti molekuly fluorescenční látky v daném prostředí 17 Zhášení luminiscence • luminiscenci konkuruje jiný děj, který vede k poklesu intenzity luminiscence • všechny možné procesy zhášení ještě nejsou zcela vysvětleny Přístrojová technika •Zdroj exitačního záření (Hg výbojka, halogenové výbojky, Xe výbojka, lasery). •Filtr (Woodův fitr skla s příměsí NiO, CuO, CoO). •Měřicí prostor •Interferenční filtr propouštějící fluorescenční signál. •Detektor • Měření fluorescence •Fluorimetry •Spektrofluorimetry •Fluorescenční skenery •Fluorescenční mikroskopy •Průtokové cytometry vzorek emisní monochromátor detektor zdroj excitační monochromátor čtecí zařízení ☼ Mexcit Vzorek Memis D Schéma fluorimetru excitační zdroj monochromátorexcitačního záření kyveta se vzorkem monochromátoremitovaného záření detektor • je vyvolána energií chemické reakce (většinou oxidace) • jednoduché přístrojové vybavení bez zdroje primárního záření, nižší vliv matrice, stanovení nižších koncentrací •Elektrochemiluminiscence • je modifikace chemiluminiscence, kdy luminiscence je generována chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky • Chemiluminiscence Chemiluminiscence Molekula v základním stavu Molekula v excitovaném stavu Molekula v základním stavu + Luminiscence Chemická reakce A + B à X* à P + hν Luminofory/fluorofory jsou molekuly nebo jejich části, které vyzařují luminiscenční záření (fluoreskují) •Přirozené - Aromatické aminokyseliny (v bílkovinách), např. tryptofan - NADH, riboflavin, FAD, porfyriny •Analytické (fluorescenční značky nebo sondy) Přirozené fluorofory • •Polyaromatické uhlovodíky •Vitamin A, E •FAD, FMN (450/525 nm) x FADH, FMNH •NADH (340/460 nm) x NAD+ •Karoteny •Chinin •Steroidy •Aromatické aminokyseliny •Nukleotidy •Fluoreskující proteiny - GFP (green fluorescent protein) Analytické luminofory/fluorofory • Luminol, isoluminol • Fluorescein • Methylumbelliferon (MU) • Akridin a jeho estery • Adamantyl dioxetan • Cheláty lanthanoidů (Europium) Nejčastěji jsou navázány jako značka (na protilátky nebo antigeny) nebo jsou použity jako substrát. Luminol (5-aminoftalhydrazid) •2H2O2 = 2 H2O + O2 (peroxidasa) • •Luminol + 2H2O +O2 ® aminoftalát + N2 +3H2O+ světlo luminol2 Methylumbelliferon (MU) • •MUP MU + P + luminiscence •4-metylumbelliferyl fosfát 4-metylumbelliferon + fosfát • + luminiscence • • • • •(defosforylace substrátu) MFCD00016969 ALP Chemiflex™ (Abbott) Patentovaný ester akridinu akridinium(N-sulfonyl)karboxamid Sloučenina je velmi stálá Reakce: - oxidace v kyselém prostředí (pH=2; HNO3 a H2O2) - změna prostředí na zásadité (NaOH) - vznik nestabilní N-sulfonylpropylakridon v excitovaném stavu - při přechodu do stabilní formy se uvolní CO2 a energie v podobě světla (430nm) Lumigen® (Siemens, DPC) Fosfátový ester adamantyl dioxetanu Reakce: - defosforylace substrátu účinkem ALP - vznik nestabilního meziproduktu v excitovaném stavu - při jeho tvorbě je emitován tok fotonů 30 Luminiscence lanthanoidů Některé komplexy Ln(III) mají velmi neobvyklé spektrální vlastnosti: ü dlouhý čas vyhasínání luminiscence ü Stokesův posun může být i více než 100 nm ü emisní spektrum obsahuje ostré píky •CMIA (chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích) CHEMILUMINISCENT MICROPARTICLE IMMUNOASSAY •ECLIA (elektrochemiluminiscence) •FPIA (fluorescenční polarizační imunoanalýza) FLUORESCENCE POLARIZATION IMMUNOASSAY •MEIA (enzymová imunoanalýza na mikročásticích) MICROPARTICLE ENZYME IMMUNOASSAY Fluorescenční imunoanalytické metody (FIA) CMIA Chemiluminiscenční imunoanalýza na mikročásticích •Heterogenní imunoanalýza - separace pevnou fází •Paramagnetické mikročástice •Emise světla molekulou, která je produktem chemické reakce • •Systém není ozařován zdrojem světla. •Intenzita záření odpovídá počtu chemiluminiscenčních molekul • (1 molekula = 1 kvantum světla) •Reakční postupy mohou být jedno nebo dvou stupňové •Kompetitivní uspořádání Paramagnetické částice Krystaly kysličníků železa v velký povrch v magnetické vlastnosti • modifikace chemiluminiscence, světlo je generováno chemickými reakcemi iniciovaných elektrochemicky • • • •Na platinové elektrodě je chelát Ru2+ oxidován na Ru3+, • zároveň je tripropylamin (TPA+) oxidován na radikál TPA+ • (má redukční vlastnosti, snadno redukuje Ru3+komplex na Ru2+, • elektron z TPA přeskočí do vyšší energetické hladiny Ru kationtu, přechodem do základního stavu dojde k luminiscenci a Ru komplex je opět schopen další oxidace) • •Ru kation prochází reakcí cyklicky, nespotřebovává se, chová se jako enzym • •Cheláty ruthenia se používají jako luminiscenční značka vzniklých imunokomplexů • •TPA se rozpadá na dipropylamin, je v reakci spotřebováván, slouží jako substrát • Elecsys 2010 (Roche) Elecsys 2010 FPIA Fluorescenční polarizační imunoanalýza Fluorescence Polarization Immunoassay •Homogenní kompetitivní immunoanalýza, měření se provádí ve dvou polarizačních rovinách •Využívá různé rychlosti rotace velkých a malých molekul, které vedou ke změně polarizace (použití pouze pro malé molekuly, např. léky) •Výsledná polarizace je nepřímo úměrná koncentraci analytu ve vzorku. •Fluorescence vyvolaná lineárně polarizovaným světlem je také lineárně polarizovaná •Je-li fluorofor vázán na velkou molekulu (komplex značený antigen-protilátka), nemůže volně rotovat a emitované světlo kmitá ve stejné rovině jako excitující – polarizace zůstane zachována • •Volný fluorofor může volně rotovat, emitované světlo kmitá v jiné rovině než excitující – polarizace se zeslabuje FPIA Nízká koncentrace analytu ... vzorek značka/tracer + + Vysoká polarizace = + protilátka Vysoká koncentrace analytu ... vzorek značka/tracer + + Nízká polarizace = + protilátka MEIA Enzymová imunoanalýza na mikročásticích Microparticle Enzyme Immunoassay •Heterogenní enzymová imunoanalýza na mikročásticích •Imunokomplex značený enzymem ( ALP) •Fluorogenní substrát (MUP, 4-metylumbelliferylfosfát) reaguje s enzymem (ALP) •Defosforylace substrátu (MUP MU) • (4-metylumbelliferon), luminiscence • Dissociation-enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay • • Protilátky nebo antigeny jsou značeny cheláty lanthanoidů: Eu (europia), Sm (samaria) a Tb (terbia) • Cheláty lanthanoidů vykazují velký Stokesův posun a delší dobu emise. • (Pozn.: použití jako luminofor v obrazovkách barevných televizorů) • Nekompetitivní sendvičová technika chráněná patentem. DELFIA • •Po imunochemické reakci se tento chelát přemění na fluoreskující sloučeninu •Detekce záření se zpožděním (odstranění interferujícího záření) •Pulzní zdroj (340nm, tisíce pulzů/s) • Po každém záblesku: • 400 µs prodleva • 400 µs měření emitovaného záření • (Nespecifická emise 10 ns) • • • • • •Kongenitální hypotyreóza (SKH) • Snížená funkce štítné žlázy vede ke zvýšení koncentrace TSH •Kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) • Defekt steroidogeneze v kůře nadledvin; • nejčastěji deficit enzymu P450c21 (21-hydroxylázy) • zvýšení koncentrace 17 OHP (17-0H-progesteronu) • •Fenylketonurie/hyperfenylalaninémie Využití: „Celoplošný laboratorní novorozenecký screening“ • •Homogenní fluorescenční imunoanalýza •Využití kryptandů (=sloučeniny, které fluorofor Eu3+ váží v trisdipyridylové „kleci“ •Kryptandem je značený antigen nebo protilátka •Na druhou protilátku je vázán fluorofor, který je excitován při jiné vlnové délce než Eu •Imunokomplex je excitován laserem při 337 nm •Energie přenesená z kryptandu na fluorofor je detekována při 665 nm jako prodloužený signál •TRACE Time Resolved Amplified Cryptate Emission Časové modulovaná detekce fluorescence 48 FISH •Fluorescence In Situ Hybridization je cytogenetická metoda, která umožňuje detekci a lokalizaci konkrétních sekvencí DNA v chromosomech •tato metoda je určená k mapování genů a sledování chromosomálních abnomalit, atd. •pro detekci se využívá fluorescenční mikroskopie • 49 FISH •krátký jednovláknový (single stranded) úsek DNA, který je komplementární k hledané sekvenci, je označen fluorescenční značkou •v rozpletených úsecích DNA dochází k navázání na komplementární části •dochází k nalezení a označení části sekvence, která kóduje zkoumaný úsek • Nositelé Nobelovy ceny 2008 za chemii •Osamu Shimomura jako první izoloval zelený fluoreskující protein z medúzy Aequorea victoria (GFP) •Martin Chalfie první prakticky využil fluorescenčního proteinu (značení neuronů pro hmatové receptory) •Roger Y. Tsien objasnil fluorescenční mechanizmus GFP a různými modifikacemi rozšířil paletu barev (emitovaného záření) Použití GFP v chemii a biologii •lze připravit protein, který obsahuje sekvenci (např. Ser-Tyr-Gly), který má vlastnosti stejné jako ostatní proteiny, ale je mnohem lépe detekovatelný • •genové inženýrství – sekvenci z DNA medusy, která je zodpovědná za tvorbu GFP lze vpravit do DNA jiného organismu, např. i savce... albagreen GFK – Green Fluorescent Králík