Stanovení aktivity enzymů Stanovení katalytické koncentrace alaninaminotransferasy (ALT) Alaninaminotransferasa (l-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa) katalyzuje reakci ALT l-alanin + 2-oxoglutarát pyruvát + l-glutamát Doplňte vzorce všech reaktantů a produktů : ………………………………………………………………………………………….. Po této enzymové reakci následuje reakce další, na jejímž základě je umožněno měření enzymové aktivity ALT. Doplňte rovnici této reakce. Popište, jak budete dále postupovat při použití kinetické metody k zjištění aktivity ALT: Materiál: : pracovní roztok obsahující Tris pufr 110 mmol/l, pH 7,3; pyridoxal-5-fosfát 0,1 mmol/l, l-alanin 550 mmol/l; LDH ³ 21,7 mkat/l; NADH 0,198 mmol/l; 2-oxoglutarát 16,5 mmol/l (připraví se z činidel soupravy dle návodu). Vzorek krevního séra. Vysvětlete význam všech reagencií. Provedení (manuelní): Kyvetu fotometru naplňte destilovanou vodou a při vlnové délce 340 nm fotometr vynulujte. Vodu z kyvety vylejte. Do kyvety předehřáté na 37 °C odměřte 1 ml pracovního roztoku. Kyvetu vložte do kyvetového prostoru fotometru a nechejte 5 min předehřát (tuto dobu je nutné dodržet!). Přidejte do kyvety mikrodávkovačem 0,1 ml vzorku séra a tyčinkou opatrně promíchejte. Tím je zahájena první enzymová reakce, v návaznosti na ni probíhá ihned reakce druhá. Zaznamenejte čas v okamžiku smíchání a v intervalech po 15 s zapisujte absorbance vzorku v kyvetě po dobu 5 minut. Naměřené hodnoty vyneste do grafu. Z přímkové části grafu vypočítejte průměrnou rychlost poklesu absorbance DA[340]/min (viz obr.): Výpočet: Katalytická koncentrace ALT v séru: Vysvětlete význam všech složek vztahu pro výpočet katalytické koncentrace. Proč počáteční část grafu není přímková? Využití enzymů jako analytických činidel. Enzymy mohou být rovněž využity k měření koncentrace substrátu. Při stanovení musí být zachovány stejné obecné požadavky pro optimální průběh enzymové reakce. Jediný rozdíl je v tom, že rychlost reakce je limitována koncentrací substrátu (reakce prvního řádu vůči substrátu), zatímco koncentrace enzymu musí být taková, aby nelimitovala rychlost reakce. Na rozdíl od reakcí, při nichž se měří enzymová aktivita, reakce využívající enzymy ke stanovení koncentrace substrátu jsou obvykle kalibrovány paralelní analýzou substrátu o známé koncentraci. Podobně jako u enzymových esejí mohou být využívány spřažené reakce. S SP P · Metoda end-point (stanovení se provádí z celého průběhu reakce – do koncového bodu, všechen substrát musí zreagovat) – reakce musí být rychlá a kvantitativní. Koncentrace substrátu jsou často nízké, [S] <