Speciální koagulační
vyšetření I
Koagulační faktoryKoagulační faktory
Vyšetření funkční aktivityVyšetření funkční aktivity
jednofázová metoda na principu APTTjednofázová metoda na principu APTT
FF VIII, IX, XI, XII, PK, HMWKFF VIII, IX, XI, XII, PK, HMWK
jednofázová metoda na principu PTjednofázová metoda na principu PT
FF II, V, VII, XFF II, V, VII, X
Vyšetření antigenuVyšetření antigenu
EID, ELISAEID, ELISA
jiné faktory
VIII
?
jiné faktory
VIII
VIII
?
jiné faktory
F VIII deficitní plazmavyšetřovaná plazma
jiné faktory VIII
?
ředění 1:10 pufrem
APTT
koagulační čas závisí na aktivitě F VIII
Vyšetření funkční aktivityVyšetření funkční aktivity
koagulačních faktorůkoagulačních faktorů
Postup:Postup:
1 díl ředěné vyšetřované plazmy1 díl ředěné vyšetřované plazmy
1 díl neředěné deficitní plazmy1 díl neředěné deficitní plazmy
FF vnitřního systémuFF vnitřního systému
1 díl APTT reagencie, inkubace1 díl APTT reagencie, inkubace
1 díl1 díl CaClCaCl22
FF vnějšího systémuFF vnějšího systému
inkubace, 2 díly Cainkubace, 2 díly Ca2+2+
--tromboplastinutromboplastinu
stanovení koagulačního času APTT/PTstanovení koagulačního času APTT/PT
odečtení % z kalibrační křivkyodečtení % z kalibrační křivky
Koagulační faktoryKoagulační faktory -- kalibracekalibrace
Kalibrační materiálKalibrační materiál
komerčníkomerční
VyšetřeníVyšetření
různých ředění výchozí kalibrační plazmy srůzných ředění výchozí kalibrační plazmy s
udanou hladinou FF:100%, 50 %, 25 %,12,5% ,udanou hladinou FF:100%, 50 %, 25 %,12,5% ,
(pro F VIII, IX 6,25 %, ...)(pro F VIII, IX 6,25 %, ...)
Kalibrace čtyř…více bodováKalibrace čtyř…více bodová
Závislost log/logZávislost log/log
Klinický významKlinický význam -- zejménazejména ↓↓ FF ,FF , ↑↑ F VIIIF VIII
Defekty faktorůDefekty faktorů
VrozenýVrozený
hemofílie A, hemofílie B, defekt FF XII, XI,hemofílie A, hemofílie B, defekt FF XII, XI,
PK, HMWK,PK, HMWK, vWFvWF, defekt FF II, V, VII, X, defekt FF II, V, VII, X
ZískanýZískaný
snížená syntézasnížená syntéza
zvýšená spotřebazvýšená spotřeba
zvýšené ztrátyzvýšené ztráty
Snížení faktorůSnížení faktorů
SníženíSnížení -- mimomimo kalibrovanoukalibrovanou oblast (oblast (<< 10 %)10 %)
Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10
opakování vyšetření s nižším ředěním plazmy (1 : 5)opakování vyšetření s nižším ředěním plazmy (1 : 5)
odečtení a vydělení výsledkuodečtení a vydělení výsledku dilučnímdilučním faktorem (:2)faktorem (:2)
Zvýšení F VIIIZvýšení F VIII
Zvýšení > 100 %Zvýšení > 100 %
Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10Výchozí ředění vyšetřované plazmy 1 :10
opakovat vyšetření s vyšším ředěním plazmy 1 : 20opakovat vyšetření s vyšším ředěním plazmy 1 : 20
odečíst a vynásobit výsledekodečíst a vynásobit výsledek dilučnímdilučním faktorem (x2)faktorem (x2)
Pro F VIII > 200 %Pro F VIII > 200 %
opakovat s ředěním 1:40opakovat s ředěním 1:40
odečíst a vynásobit 4xodečíst a vynásobit 4x
Pro F VIII > 400 %Pro F VIII > 400 %
opakovat s ředěním 1:80opakovat s ředěním 1:80
odečíst a vynásobit 8xodečíst a vynásobit 8x
Korekční testyKorekční testy
sledování korekce (zkrácení) APTT/PT posledování korekce (zkrácení) APTT/PT po
přídavku normální plazmy (přídavku normální plazmy (směs 1:1směs 1:1))
prodloužení se korigujeprodloužení se koriguje -- defekt faktorůdefekt faktorů
prodloužení se nekoriguje nebo jenprodloužení se nekoriguje nebo jen
částečněčástečně -- přítomnost inhibitorupřítomnost inhibitoru
specifickéhospecifického
nespecifickéhonespecifického
Identifikace specifického inhibitoruIdentifikace specifického inhibitoru
Inhibitor namířený proti FF, časově závislýInhibitor namířený proti FF, časově závislý
Orientačně tzv. „Orientačně tzv. „cirkulující antikoagulanscirkulující antikoagulans““
Vyšetření APTT/PT u vzorků plazmy pacienta,Vyšetření APTT/PT u vzorků plazmy pacienta,
normálu a směsí P+N (normálu a směsí P+N (1+4, 1+1, 4+11+4, 1+1, 4+1) před a) před a
po 2 hodinové inkubaci při 37 °Cpo 2 hodinové inkubaci při 37 °C
CirkulujícíCirkulující antikoagulansantikoagulans
vyhodnocení výsledkůvyhodnocení výsledků
Porovnání naměřených koagulačních časůPorovnání naměřených koagulačních časů
jednotlivých směsí P + N s časy P a Njednotlivých směsí P + N s časy P a N
před inkubacípřed inkubací
po inkubacipo inkubaci
Průkaz inhibitoruPrůkaz inhibitoru
příměs 1/5příměs 1/5 pacpac. plazmy výrazně prodlužuje čas. plazmy výrazně prodlužuje čas
normálunormálu
příměs 1/5příměs 1/5 normnorm. plazmy nezpůsobí korekci. plazmy nezpůsobí korekci
časů plasmy pacientačasů plasmy pacienta
CirkulujícíCirkulující antikoagulansantikoagulans
grafické znázorněnígrafické znázornění
0%0% == NPNP
20%20% == směs NP+PP 4+1směs NP+PP 4+1
50%50% == směs NP+PP 1+1směs NP+PP 1+1
80%80% == směs NP+PP 1+4směs NP+PP 1+4
100%100% == PPPP
CirkulujícíCirkulující antikoagulansantikoagulans APTTAPTT
-- defekt faktorůdefekt faktorů
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před
ink
po ink
CirkulujícíCirkulující antikoagulansantikoagulans APTTAPTT
-- specifický inhibitorspecifický inhibitor
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před ink
po ink
CirkulujícíCirkulující antikoagulansantikoagulans APTTAPTT
-- lupuslupus antikoagulansantikoagulans
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0% 20% 50% 80% 100%
sec
před ink
po ink
Identifikace specifického inhibitoruIdentifikace specifického inhibitoru
Test „cirkulujícíTest „cirkulující antikoagulansantikoagulans““
orientační vyšetření, kterým pouze prokazujemeorientační vyšetření, kterým pouze prokazujeme
přítomnost/ nepřítomnost inhibitorupřítomnost/ nepřítomnost inhibitoru
časovou závislost/ nezávislost inhibitoručasovou závislost/ nezávislost inhibitoru
Identifikace specifického inhibitoruIdentifikace specifického inhibitoru
KvantitativněKvantitativně BethesdaBethesda metodametoda
stanovení zbytkové aktivity faktoru po dvoustanovení zbytkové aktivity faktoru po dvou
hodinové inkubaci různých ředění pacientovyhodinové inkubaci různých ředění pacientovy
plazmy s normální plazmou (zdroj faktoru).plazmy s normální plazmou (zdroj faktoru).
11 BethesdaBethesda jednotka (B.U.)jednotka (B.U.)
množství inhibitoru, které během inkubacemnožství inhibitoru, které během inkubace
inaktivujeinaktivuje 50 % nabídnutého faktoru50 % nabídnutého faktoru
přítomnost inhibitorupřítomnost inhibitoru ≥≥ 0,6 B.U.0,6 B.U.
Identifikace LA dle SSCC ISTHIdentifikace LA dle SSCC ISTH
průkaz prodlouženíprůkaz prodloužení fosfolipidfosfolipid závislého testuzávislého testu
((dAPTTdAPTT,, dRVVTdRVVT) =) = screeningscreening
průkaz inhibitoru (negativní korekční testy)průkaz inhibitoru (negativní korekční testy)
průkazprůkaz fosfolipidovéfosfolipidové závislosti inhibitoruzávislosti inhibitoru
(neutralizační testy)(neutralizační testy)
PoužitíPoužití bezdestičkovébezdestičkové plazmyplazmy (PFP)(PFP)
dvojnásobnádvojnásobná centrifugacecentrifugace + filtrace+ filtrace
ScreeningovéScreeningové testytesty -- LALA
dAPTTdAPTT
snížený obsahsnížený obsah fosfolipidůfosfolipidů
vhodné zastoupenívhodné zastoupení fosfolipidůfosfolipidů
dRVVTdRVVT (aktivuje F X v přítomnosti PL a Ca(aktivuje F X v přítomnosti PL a Ca2+2+
))
snížený obsahsnížený obsah fosfolipidůfosfolipidů
vhodné zastoupenívhodné zastoupení fosfolipidůfosfolipidů
Korekční testyKorekční testy -- LALA
na principu testů, které vena principu testů, které ve screeninguscreeningu prodlouženéprodloužené
RR > 1,2> 1,2
vvyšetření PP, NP a směsi PP a NP v poměru 1 : 1yšetření PP, NP a směsi PP a NP v poměru 1 : 1
bez inkubace (časově nezávislý inhibitor)bez inkubace (časově nezávislý inhibitor)
PrůkazPrůkaz fosfolipidovéfosfolipidové závislostizávislosti -- LALA
Testy se zvýšenou koncentracíTesty se zvýšenou koncentrací fosfolipidůfosfolipidů
na principu testů, které vena principu testů, které ve screeninguscreeningu
prodloužené a nedošlo ke korekciprodloužené a nedošlo ke korekci
vyhodnocení zkrácení koagulačních časůvyhodnocení zkrácení koagulačních časů
v přítomnosti nadbytkuv přítomnosti nadbytku fosfolipidůfosfolipidů
reagencie sreagencie s PL (APTT i RVVT)PL (APTT i RVVT)
po přídavku nadbytku PLpo přídavku nadbytku PL
destičkovýchdestičkových --test PNPtest PNP ((Platelet NeutralisationPlatelet Neutralisation
ProcedureProcedure))
v hexagonální fáziv hexagonální fázi -- test HNPtest HNP ((HexagonalHexagonal
Neutralisation ProcedureNeutralisation Procedure))
Vyšetření faktoru XIIIVyšetření faktoru XIII
Stanovení funkční aktivityStanovení funkční aktivity
sledování rozpustnostisledování rozpustnosti koagulakoagula
fotometrickyfotometricky
Stanovení antigenuStanovení antigenu
EIDEID
ELISAELISA
Testy primárníTesty primární hemostázyhemostázy
počet trombocytů (+ morfologie)počet trombocytů (+ morfologie)
doba krvácení (doba krvácení (DukeDuke, Ivy), Ivy)
PFAPFA
agregace trombocytůagregace trombocytů
retrakce koagularetrakce koagula
Agregace trombocytůAgregace trombocytů
Turbidimetrická metodaTurbidimetrická metoda
sledování změn průchodnosti světla (T) přisledování změn průchodnosti světla (T) při
tvorbě agregátů krevních destičektvorbě agregátů krevních destiček
Impedanční metodaImpedanční metoda
sledování změn vodivosti vyvolaných tvorbousledování změn vodivosti vyvolaných tvorbou
agregátů krevních destičekagregátů krevních destiček
Agregace trombocytůAgregace trombocytů
Agregace samovolná (spontánní)Agregace samovolná (spontánní)
Agregace stimulovaná (indukovaná)Agregace stimulovaná (indukovaná)
induktoryinduktory ADP, kolagen, adrenalin,ADP, kolagen, adrenalin, ristocetinristocetin
primární agregaceprimární agregace -- vlivem vnějšího podnětuvlivem vnějšího podnětu
sekundární agregacesekundární agregace -- vlastní příspěvek trombovlastní příspěvek trombo
reversibilní agregacereversibilní agregace
ireversibilní agregaceireversibilní agregace
Agregace trombocytůAgregace trombocytů
PostupPostup
příprava PRP, PPP diferenciálnípříprava PRP, PPP diferenciální centrifugacícentrifugací
stanovení počtu trombocytů (stanovení počtu trombocytů (eventevent. ředění PRP). ředění PRP)
PRP 250PRP 250 -- 300 x10300 x1099, PPP <20x10, PPP <20x1099
vyšetření agregacevyšetření agregace
vloženívložení kyvetykyvety s PPP a PRP (rozdíl T = 100%)s PPP a PRP (rozdíl T = 100%)
sledování agregační odpovědi v PRPsledování agregační odpovědi v PRP
samovolná 10 minsamovolná 10 min
po přídavkupo přídavku induktoruinduktoru 6 min6 min
vyhodnocení agregační křivkyvyhodnocení agregační křivky
Vyhodnocení agregační křivkyVyhodnocení agregační křivky
Maximální amplituda AMaximální amplituda A maxmax (%)(%)
v maximu (reversibilní křivka)v maximu (reversibilní křivka)
v 6. minutě (ireversibilní křivka)v 6. minutě (ireversibilní křivka)
DesagregaceDesagregace (%)(%)
jen u ADP v případě reversibilní křivkyjen u ADP v případě reversibilní křivky
Doba latence (s)Doba latence (s)
časová prodleva před agregační odpovědíčasová prodleva před agregační odpovědí
jen u kolagenujen u kolagenu
Strmost křivky =Strmost křivky = slopeslope (%/min)(%/min)
Agregační křivkaAgregační křivka
Agregace ADP 2,5Agregace ADP 2,5
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
∆ T/min desagregace
0
Agregační křivkaAgregační křivka
Agregace ADP 5Agregace ADP 5
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
∆ T/min
0
Agregační křivkaAgregační křivka
Agregace ADP 10Agregace ADP 10
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
∆ T/min
0
Agregační křivkaAgregační křivka
Agregace kolagenAgregace kolagen
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 6
Transmise %
∆ T/min
latence
0
Agregační křivkaAgregační křivka
Samovolná agregaceSamovolná agregace
čas měření (min)
A max
100%
0 %
1 10
Transmise %
pozitivní
negativní
0
RetrakceRetrakce
Schopnost trombocytů smršťovat krevní neboSchopnost trombocytů smršťovat krevní nebo
plazmaticképlazmatické koagulumkoagulum (metoda dle(metoda dle BethauseBethause))
PostupPostup
získání PRP sedimentacízískání PRP sedimentací
ředění PRP + přídavek Caředění PRP + přídavek Ca2+,2+,
CaCa2+2+
--tromboplastintromboplastin
vytvoření plazmatickéhovytvoření plazmatického koagulakoagula v graduovanév graduované
zkumavce a oddělenízkumavce a oddělení koagulakoagula od stěn zkum.od stěn zkum.
odečtení délkyodečtení délky koagulakoagula po 3 hodpo 3 hod
odečtení %odečtení % retrakceretrakce z tabulkyz tabulky
Interpretace výsledkůInterpretace výsledků
Heparin
UFH
Kumariny Defekt FF
vnitř.syst.
Defekt F
VII
Defekt FF
II,V, X
PT N, (( )) N
APTT N
Fbg N N N N N
TČ N N N N