Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno KLINICKÁ CYTOGENETIKA SEMINÁŘ KLINICKÁ CYTOGENETIKA SEMINÁŘ Mgr.Hanáková Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ODDĚLENÍ LÉKAŘSKÉ GENETIKY FN BRNO ODDĚLENÍ LÉKAŘSKÉ GENETIKY FN BRNO ambulance laboratoře klinické cytogenetiky laboratoř molekulární diagnostiky - laboratoř klasické cytogenetiky - laboratoř molekulární cytogenetiky stanovení karyotypu G – pruhování chromosomů metody – FISH, SKY, CGH, MLPA Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SCHEMA LIDSKÉ BUŇKYSCHEMA LIDSKÉ BUŇKY buněčné jádro (DNA + proteiny, RNA) cytoplasma s organelami (DNA v mitochondriích) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZMĚNA ORGANIZACE GENETICKÉHO MATERIÁLU BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU SOMATICKÝCH BUNĚK ZMĚNA ORGANIZACE GENETICKÉHO MATERIÁLU BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU SOMATICKÝCH BUNĚK mitóza (metafáze) chromosomy = spiralizované molekuly DNA 46 chromosomů lidí s normálním karyotypem jádro v interfázi – despiralizované molekuly DNA (různé stupně spiralizace) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SPIRALIZACE CHROMOSOMŮSPIRALIZACE CHROMOSOMŮ během buněčného cyklu se chromatin nachází v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký stupeň spiralizace, během mitózy postupná kondenzace, maximální v metafázi mitózy) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXICHROMOSOMY V PRAXI dvouchromatidový metafázní chromosom schema chromosomu chromosom s G- pruhy chromosom konvenčně barvený chromosom metoda FISH Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMOVÉ ABERACE (CHA) CHROMOSOMOVÉ ABERACE (CHA) Cílem cytogenetického vyšetření je zjištění přítomnosti / nepřítomnosti chromosomových aberací (patologických chromosomových změn) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍTYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ – prenatální a postnatální vyšetření - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření IHOK FN BRNO, OLG FN BRNOIHOK FN BRNO, OLG FN BRNO - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů OLG FN BRNOOLG FN BRNO Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ VYŠETŘENÍ KARYOTYPU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE • početní abnormality • polyploidie – znásobení počtu chromosomových sad (samovolné aborty) • abnormality počtu chromosomů v páru - aneuploidie (trisomie chromosomů 21, 18, 13, gonosomů, monosomie chromosomu X)- viz základní přednáška • strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní typy chromosomů – viz základní přednáška Vznik VCA - de novo - poruchy v procesu meiózy (tvorby gamet z primárních oocytů a spermatocytů); během procesu mitózy v embryu (mozaika) - zděděné – potomci rodičů – nosičů balancovaných přestaveb Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) • vyšetření chromosomů – metodami klasické cytogenetiky (G-pruhování chromosomů) vyšetření celého karyotypu (všech chromosomů) rozlišovací schopnost nejnižší (do10 Mb – přibližně 1 pruh) • vyšetření chromosomů, interfázních jader i izolované DNA - metodami molekulární cytogenetiky (vyšetření pomocí fluorescenčně značených sond, PCR) vyšetření celého karyotypu vyšetření konkrétních oblastí rozlišovací schopnost vyšší (až po rozdíly v jednotlivých nukleotidech – závisí na konkrétní metodě) • vyšetření izolované DNA - metody molekulární genetiky rozlišovací schopnost nejvyšší (rozdíly v sekvenci DNA) dvoušroubovice DNA chromosom s fluorescenčně značenými sondami (vlevo), interfázní jádro (vpravo) chromosom s G-pruhy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍVSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ • postnatální materiály: periferní krev • prenatální materiály: plodová voda, choriové klky, krev plodu, kůže potracených plodů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKYMETODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • odběr materiálu – STERILNÍ ODBĚR! • kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk (s chromosomy), zastavení dělení buněk kolchicinem • zpracování suspenze (hypotonizace, fixace) • vykapání na podložní sklíčka • pruhování / barvení chromosomů • hodnocení v mikroskopu a za pomoci počítačového programu metody 1. volby v indikovaných případech Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu aplikace kolchicinu – mitotického jedu po kultivaci kultivace v termostatu 1 2 3 nasazení periferní krve (sterilní podmínky – laminární box) nasazení plodové vody (sterilní podmínky – laminární box) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu Odběr materiálu pro účely cytogenetického vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) • do heparinu a transportního média – kostní dřeň (obv. 1-2 ml) • do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) • bez přídavku média a dalších látek – plodová voda (obv. 20 ml) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních chromosomů : • periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty • fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé T-lymfocyty • plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní fibroblasty • choriové klky – z chorionu nebo placenty - buňky choriových klků nebo placenty • kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní fibroblasty • kostní dřeň – z prsní kosti, kyčlí – prekurzory krevních buněk • solidní tumory – z nádoru – maligní buňky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • délka kultivace - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) - 48 hodin (stanovení ZCA) kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci chromosomů nebo k zániku buněk s aberací - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) - choriové klky – přes noc (stanovení karyotypu) - kostní dřeň – přímé zpracování buněk ihned po odběru - 24 hodin (48 hodin spec. případy) (stanovení karyotypu maligních klonů v KD) - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) - solidní tumory – 1 - 2 týdny (stanovení karyotypu maligních klonů v tumoru) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • kultivace buněk v suspenzi (periferní krev, fetální krev, choriové klky, kostní dřeň) • kultivace buněk přichycených na dně kultivační nádobky (plodová voda, solidní tumory, kůže) - po kultivaci pomocí roztoku trypsinu odloupneme ode dna, dále zpracováváme jako suspenzi buněk kultivace plodové vody kultivace periferní krve Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve • kultivace periferní krve v médiu s přídavkem phytohemaglutinu (PHA) = výtažek z fazolu obecného (Phaseolus vulgaris) - T-lymfocyty = zralé diferencované buňky s malou spontánní mitotickou aktivitou - vlivem PHA se dediferencují (přeměna na nezralé buňky lymfoblasty, které se dělí (tzn. jádra vstupují do mitózy!) (např. k nezralým buňkám – blastům z kostní dřeně onkologických pacientů není třeba PHA přidávat, dělí se samovolně) - význam kultivace – spiralizace chromosomů v jádrech T-lymfocytů - složení kultivačního média – živné látky, antibiotikum, PHA, stabilizátor pH Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY po kultivaci METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY po kultivaci • aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) - kolchicin je mitotický jed, který specificky inhibuje tvorbu dělícího vřeténka a tím zastavuje dělení buněk v metafázi mitózy, kdy jsou chromosomy vhodné k analýze Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • hypotonizace, fixace hypotonizace – buňky přijímají vodu, prasknou erytrocyty, zvětšení objemu T-lymfocytů, rozestoupení chromosomů fixace – usmrcení buněk, zviditelnění struktury a zlepšení barvitelnosti chromosomů, rozrušení cytoplasmy buněk, rozpuštění nečistot Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKYMETODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • vykapání suspenze na podložní sklíčka – chromosomy v buňkách ohraničených buněčnou membránou se rozestoupí – na sklíčku se nacházejí mitózy – soubory chromosomů jednotlivých buněk a interfázmí jádra • zaschnutí, zapečení Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G -pruhování chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G -pruhování chromosomů • G - pruhování chromosomů 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski vznik pruhů na povrchu chromosomů – střídavé světlé a tmavé pruhy různé intenzity Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení chromosomy s G-pruhy hodnotíme ve světelném mikroskopu zdroj světla - viditelná část spektra (halogenová žárovka) (stanovení karyotypu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení zvětšení přibližně 1000x Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení světelný mikroskop s CCD kamerou napojený na počítač ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačové analýzy obrazu počítačový program nezhodnotí karyotyp samostatně, každou mitózu zhodnotí cytogenetik za pomoci programu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI karyotyp CHROMOSOMY V PRAXI karyotyp • utříděný a zhodnocený soubor chromosomů v somatických buňkách pacienta, označujeme počet chromosomů, typ pohlavních chromosomů a případné aberace (zápis karyotypu např. 46,XY) • normální lidský karyotyp se skládá ze 46 chromosomů - 22 párů autosomů (nepohlavních chromosomů), 2 gonosomů (pohlavních chromosomů) • chromosomový pár je tvořen homologními chromosomy (jeden zděděn od otce, druhý od matky), nepárové chromosomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) obrázek = utříděný soubor chromosomů jednoho jádra, který vypovídá o chromosomech i v ostatních buňkách pacienta Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY CHROMOSOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX CHROMOSOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení Při vyšetření karyotypu analyzujeme větší počet mitóz, podle požadavku lékaře a nalezené patologie (10, 30, 50, 100). Ve spolupráci s molekulární cytogenetikou analyzujeme i 200 jader. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • vykapání suspenze na podložní sklíčka (pro některá vyšetření (FISH)) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip vazby fluorescenčně značené sondy na chromosomy nebo interfázní jádra na podložním sklíčku sonda značená sonda vazba značené sondy na cílovou DNA (chromosom) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY hodnocení METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY hodnocení chromosomy fluorescenčně značené hodnotíme ve fluorescenčním mikroskopu, zdroj světla - krátkovlnná část spektra (např. rtuťová výbojka); fluorescenční mikroskop je také součástí systému analýzy obrazu zdroj krátkovlnného vysokoenergetického zářeníspeciální filtry Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - FISH METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - FISH Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - metodami molekulární cytogenetiky upřesňujeme a potvrzujeme patologické nálezy detekované metodami klasické cytogenetiky - metody molekulární cytogenetiky odhalí velmi malé změny v karyotypu, které nelze detekovat metodami klasické cytogenetiky (nízká rozlišovací schopnost klasických metod) při vyšetřování - vrozených chromosomových aberací - získaných chromosomových aberací u onkologických pacientů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) - příklady potvrzení přítomnosti balancované translokace v karyotypu metodou FISH VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) - příklady potvrzení přítomnosti balancované translokace v karyotypu metodou FISH 46,XY,t(5;19)(q15;p12) G-pruhování chromosomů metoda FISH Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA 46,XX,del(5)(p14.1)syndrom Cri du Chat G-pruhování chromosomů (klasická cytogenetika) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 1p36 1p362p16.1 3q29 Wolf-HirschhornCriduChat SotosWilliams Langer-Giedion 9q22.3 DiGeorge2 WAGR P-W/Angelman P-W/Angelman 15q24 Miller-Diecker Smith-Magenis Smith-Magenis NF1 17q21DiGeorgeDiGeorge Phelan-McDermid MECP2dup MECP2dup metoda MLPA (metoda molekulární cytogenetiky) – potvrzení nálezu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – nebalancované aberace mikrodelece (delece menší než rozlišovací schopnost vyšetření chromosomů s G – pruhy) VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – nebalancované aberace mikrodelece (delece menší než rozlišovací schopnost vyšetření chromosomů s G – pruhy) vyšetření metodami molekulární cytogenetiky – vyšší rozlišovací schopnost (FISH) vyšetření metodami klasické cytogenetiky G-pruhování chromosomů normální karyotyp 46,XX nalezena delece na 22. chromosomu v oblasti 22q11-13 (Di George syndrom – VSV) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS • má – li pacient chromosomovou abnormalitu v karyotypu, aberace bývá většinou přítomna ve všech jeho buňkách • mozaicismus = v těle jedince jsou přítomny 2 nebo více linie buněk s odlišnou chromosomovou konstitucí - nejčastější výskyt mozaiky gonosomů (poruchy fertility) 45,X[6]/47,XXX[4]/46,XX[190] - mozaika autosomů - mozaika linie s normálním karyotypem s linií s Downovým syndromem 47,XY,+21[172]/46,XY[28] - např. linie s normálním karyotypem s linií s monosomií chromosomu 18 45,XX,-18[10]/46,XX,r(18)[190] – velmi zřídka • ve formě mozaiky mohou být přítomny numerické aberace i strukturní přestavby, početní se vyskytují častěji • nejčastější příčinou mozaicismu je nondisjunkce v časném postzygotickém mitotickém dělení (např. ztráta chromosomu č.21 z buňky zygoty s trisomií tohoto chromosomu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno 45,X[6]/46,XX[194] 10-30 mitóz hodnotíme z chromosomů s G-pruhy, zbytek vyšetření metodou FISH z interfázních jader VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy 3% hraniční patologický nález Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy 45,X[6]/46,XX[194] vyšetření % zastoupení jednotlivých linií buněk v periferní krvi pacientky metodou FISH z interfázních jader (3% zastoupení buněčné linie 45,X) 1 signál (přítomen 1 chromosom X v jádře buňky) 2 signály (přítomny 2 chromosomy X v jádře T-lymfocytu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace 12 letý pacient s diagnózou malý vzrůst VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace 12 letý pacient s diagnózou malý vzrůst buněčná linie 46,X,r(Y)? Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace buněčná linie 46,X,mar(Y)? Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace buněčná linie 46,X,t(Y;9)(p11?;q12?) t(Y;?), přítomna oblast SRY buněčná linie Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace buněčná linie 45,X Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Karyotyp – chromosomy s G - pruhy: 46,X,r(Y)?[5]/46,X,t(Y;9)(p11.32?;q12?)[4]/45,X[1] Nálezy metodou FISH: Vyšetření na interfázních jádrech: XY [120] X [70] Vyšetření na mitózách: t(Y;?), přítomna oblast SRY [26] X + marker z chromosomu Y, oblast SRY přítomna [17] X [7] složitý zápis i interpretace složitých karyotypů v mozaice Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - význam VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - význam • je obtížné posoudit význam nálezu mozaiky - záleží na typu chromosomové abnormality - význam má % zastoupení linie s patologickým karyotypem - % zastoupení jednotlivých buněčných linií může být v různých tkáních rozdílné (vyšetření z periferní krve, stěru z bukální sliznice pro ověření a porovnání) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VZNIK MOZAIKY (vždy de novo, nedědí se) VZNIK MOZAIKY (vždy de novo, nedědí se) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno M fáze buněčného cyklu = MITÓZA postupná kondenzace chromatinu až do maxima v metafázi, vznik chromosomů (chromosomy tvořeny dvěma chromatidami) oddělení sesterských chromatid v centromeře v anafázi (chromosomů je dvojnásobný počet a jsou tvořeny jednou chromatidou) – podélné dělení centromery segregace dceřinných chromatid (samostatných chromosomů), pohybují se k protilehlým pólům buňky VZNIK MOZAICISMU - SESTERSKÉ CHROMATIDY SE NEROZEJDOU K OPAČNÝM PÓLŮM (abnormální rozchod, mitotická nondisjunkce) mitóza je dokončena cytokinezí - rozdělením cytoplazmy původně mateřské buňky za vzniku dvou dceřinných buněk, jejichž jádra obsahují stejnou genetickou výbavu jako buňka mateřská (dělení buňky) rozchod dceřinných chromatid v anafázi mitózy MITÓZA (proces dělení somatických buněk)MITÓZA (proces dělení somatických buněk) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ROZESTUP SESTERSKÝCH CHROMATID V ANAFÁZI MITÓZY ROZESTUP SESTERSKÝCH CHROMATID V ANAFÁZI MITÓZY M fáze = MITÓZA chromosomy v anafázi mitózy průběh rozchodu chromatid metafázní dvouchromatidový chromosom dva jednochromatidové chromosomy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika AMC – odběr plodové vody – přítomnost pravého mozaicismu u plodu (v těle plodu jsou přítomny 2 nebo více buněčných linií, jejichž karyotyp je odlišný) např. 47,XX,+21 [35] / 46,XX [65] – riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu (kultivační artefakt) (např. přítomnost nadbytečného chromosomu nebo strukturní přestavby v 1 mitóze) vyloučení kultivačního artefaktu - kultivace 2 paralelních kultur z AMC - opakovaný odběr (AMC, CVS) - riziko kontaminace mateřskou krví při odběru - po kultivaci nemůže ovlivnit výsledek karyotypu plodu, protože buňky mateřské krve se nenakultivují v médiu specifickém pro kožní fibroblasty - riziko kontaminace mateřskou tkání při odběru – může ovlivnit výsledek karyotypu plodu, kožní fibroblasty matky i plodu podléhají kultivaci mozaicismus - přítomnost 2 nebo více buněčných linií ve vyšetřované tkáni, které se liší karyotypem NE VŽDY SE JEDNÁ O PRAVÝ MOZAICISMUS INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY analýza buněk plodu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika – pravý mozaicismus – rozdílný karyotyp u embrya a v extraembryonální tkáni (kromě toho jak u plodu, tak v klcích, může být karyotyp s pravou mozaikou nebo bez mozaiky) - riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu hrozí u dlouhodobě kultivovaných vzorků - při dlouhodobé kultivaci existuje riziko vzniku pseudomozaiky způsobené kontaminací mateřskou tkání (pouze u plodů ženského pohlaví) – prevence – pečlivé oddělení mateřské tkáně před kultivací - kontaminace mateřskou krví pro cytogenetické vyšetření nevadí (buňky krve se nenakultivují za podmínek kultivace choriových klků); pro molekulárně genetické vyšetření je kontaminace krví matky na závadu – izolujeme DNA současně z krve i klků – směs DNA plodu a matky) Přibližně 2% vyšetření vzorků z CVS přinášejí nejednoznačný výsledek v důsledku chromosomového mozaicismu (zahrnuje pravý mozaicismus a pseudomozaicismus). V těchto případech je pro potvrzení případné chromosomové aberace doporučeno indikovat AMC. INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY CVS - biopsie choriových klků (chorionic villi sampling) analýza extraembryonální tkáně (plodový obal chorion) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika - je možný rozdílný nález karyotypu embrya a extraembryonální tkáně - riziko, že klky mají normální karyotyp a plod trisomii je minimální - sporné nálezy jsou potvrzovány AMC placentární mozaicismus – možný zdroj falešně pozitivních výsledků pravý mozaicismus u choriových klků INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY Klinická genetika, Thompson and Thompson 2004 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ VCAVÝZNAM VYŠETŘENÍ VCA - objasnit příčinu zdravotních potíží pacienta - stanovit prognózu onemocnění, nabídnout pacientovi možnosti léčby a péče - prevence výskytu vrozených chromosomových aberací v rodině VCA léčbou nevymizí Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů VYŠETŘENÍ KARYOTYPU MALIGNÍCH KLONŮ Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍVSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ kostní dřeň solidní nádory periferní krev Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮVYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮ vyšetření v laboratořích klasické a molekulární cytogenetiky klasická cytogenetika – kultivace, zpracování vstupních materiálů založeny na obdobných principech - G-pruhování chromosomů molekulární cytogenetika – metoda FISH, SKY, CGH a další metody stanovujeme KARYOTYP MALIGNÍCH KLONŮ – v nádorové tkáni mohou být přítomny skupiny buněk s odlišným karyotypem – klony – v rámci klonu stejný karyotyp Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů • početní abnormality • abnormality počtu chromosomových sad (obv. se nejedná o přesný násobek haploidního počtu) - polyploidie (hypo-, hyper- (di-, tri- atd.) ploidie) • abnormality počtu chromosomů v páru - aneuploidie (trisomie, monosomie)- často se týká jiných chromosomů než u vrozených chromosomových aberací • strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní typy chromosomů – konkrétní aberace odlišné od VCA • amplifikace (mnohonásobné zmnožení onkogenu, detekovatelné cytogeneticky) – pouze u onkologických pacientů – souvisí se vznikem a progresí onkologického onemocnění (poruchy dělení somatických buněk), vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) smíšený germinální tumor Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS • nádorové buňky tvoří klony • klon - skupina geneticky identických buněk – z pohledu cytogenetiky se stejným karyotypem (v nádorové tkáni pacienta se může vyskytovat více buněčných klonů, každý z nich nese jiné aberace) (stanovení karyotypu maligních klonů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů U onkologických pacientů vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením, v souvislosti s onemocněním vznikají chromosomové změny. Cytogenetické vyšetření přesněji charakterizuje nádor, typ nalezených aberací vypovídá o prognóze, fázi onemocnění. Pomáhá zpřesnit diagnózu, stanovit prognózu onemocnění, monitorovat úspěšnost léčby. Cílem je záchrana života pacienta. – některé translokace – vznik fúzních genů, jejichž produkty mají změněnou funkci podporující nebo způsobující nádorové bujení - některé chromosomové změny souvisejí s horší/ lepší/ střední prognózou Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí - z periferní krve VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí - z periferní krve STANOVENÍ % ABERANTNÍCH BUNĚK Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) • vlivem mutagenních faktorů prostředí dochází na chromosomech ke změnám (zlomy, vznik di-, tricentrických chromosomů, ring chromosomů ad.) – nacházíme různé změny v různých buňkách (v každé buňce jinou – nejedná se o mozaiku, ale o náhodné změny) (stanovení % aberantních buněk, hraniční patologie opakovaně 5% ab. b.) dicchrb vyšetření z periferní krve metodou klasické cytogenetiky – konvenční barvení chromosomů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve • rychlejší stárnutí organismu • vznik degenerativních onemocnění • možné maligní zvrhnutí Přítomnost aberací v somatických buňkách Přítomnost aberací v gametách • zvýšené riziko narození postiženého dítěte Konvenční barvení chromosomů Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů • konvenční barvení chromosomů (srovnání s postupem při přípravě chromosomů s G – pruhy – mitózy na sklíčcích po zaschnutí obarvíme v barvě Giemsa-Romanowski bez předchozí inkubace v roztoku trypsinu) 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski chromosomy homogenně obarvené po celé délce, bez příčných pruhů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku působení - fyzikálních faktorů (ionizující záření) - chemických látek (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, alkylační činidla ad. látky používané v průmyslu) - biologických faktorů (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, zarděnky ad.) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • jednochromatidové gapy (mezery) (G´nebo chtg – chromatid gap)- příčně slabě se barvící část chromatidy achromatické léze), také úplné přerušení chromatidy nepřesahující její šířku Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • jednochromatidové zlomy (Z´nebo chtb – chromatid brake), oddělení samostatného fragmentu (F) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece (fragmenty mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace označení cht • výměny (V nebo chte – chromatid exchange)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromosomů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace - výměny ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromatidové aberace - výměny Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • chromosomové zlomy (Z´´nebo chrb – chromosome break), oddělení párových fragmentů (DF)- úplné přerušení obou chromatid, pravděpodobně koncová delece (fragment obvykle leží paralelně, mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • chromosomové gapy (mezery) (G´´nebo chrg – chromosome gap)- příčně slabě se barvící část chromosomu (achromatické léze), také úplné přerušení chromosomu nepřesahující šířku chromatidy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • acentrické ringy, kruhové chromosomyuzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromosomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromosomy zahrnují centromeru Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)typ poškození – chromosomové aberace označení chr • chromosomy zahrnující více než 1 centromerudicentrické, tricentrické chromosomy… Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno důležité odlišnosti mezi přípravou preparátů z periferní krve pro: 1. stanovení karyotypu – chromosomy s G – pruhy - délka kultivace 72 hodin - G-pruhování = inkubace v trypsinu + směs barviv Giemsa – Romanowski - zajímá nás typ aberace, snažíme se ji co nejpřesněji definovat 2. stanovení % aberantních buněk – chromosomy konvenčně barvené - délka kultivace 48 hodin (je třeba zachytit 1. buněčné dělení – později dochází k opravě aberací) - konvenční barvení = pouze Giemsa – Romanowski bez trypsinu - nezajímá nás konkrétní typ aberace, pouze jestli je/není v dané buňce některá přítomna VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k vyšetření ZCA (mutagenní faktory) Klinické indikace k vyšetření ZCA (mutagenní faktory) • práce v riziku (kontakt se škodlivými látkami, zářením), vstupní prohlídky na pracovištích se zvýšeným rizikem • před chemoterapií, po chemoterapii, po jiné dlouhodobé léčbě • kontrolní vyšetření u podchycených případů aberace vymizí po léčbě (vitamíny) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno děkuji za pozornostděkuji za pozornost