OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno KLINICKÁ CYTOGENETIKA SEMINÁŘ Mgr.Hanáková OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ODDĚLENÍ LÉKAŘSKÉ GENETIKY FN BRNO •ambulance laboratoře klinické cytogenetiky laboratoř molekulární diagnostiky - laboratoř klasické cytogenetiky - laboratoř molekulární cytogenetiky stanovení karyotypu G – pruhování chromosomů metody – FISH, SKY, CGH, MLPA OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SCHEMA LIDSKÉ BUŇKY •buněčné jádro •(DNA + proteiny, RNA) img003 cytoplasma s organelami (DNA v mitochondriích) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno interf buňka ZMĚNA ORGANIZACE GENETICKÉHO MATERIÁLU BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU SOMATICKÝCH BUNĚK mitóza (metafáze) chromosomy = spiralizované molekuly DNA 46 chromosomů lidí s normálním karyotypem jádro v interfázi – despiralizované molekuly DNA (různé stupně spiralizace) mitóza OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SPIRALIZACE CHROMOSOMŮ •během buněčného cyklu •se chromatin nachází •v různých fázích spiralizace •(v interfázi nízký stupeň •spiralizace, během mitózy •postupná kondenzace, •maximální v metafázi •mitózy) • spiral DNA OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI • dvouchromatidový metafázní chromosom • schema chromosomu chromosom s G- pruhy 12-8 zlomy1 img001 chromosom konvenčně barvený q dl ram text p kr ram text centrom text sest chromatidy text 1151-06wcp chromosom metoda FISH OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMOVÉ ABERACE (CHA) Cílem cytogenetického vyšetření je zjištění přítomnosti / nepřítomnosti chromosomových aberací (patologických chromosomových změn) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno TYPY CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ - VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ – prenatální a postnatální vyšetření - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (vznikajících v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí na člověka) – postnatální vyšetření IHOK FN BRNO, OLG FN BRNO - VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ (u onkologických onemocnění) vyšetření z kostní dřeně a tkáně solidních tumorů OLG FN BRNO OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE •početní abnormality •polyploidie – znásobení počtu chromosomových sad • (samovolné aborty) •abnormality počtu chromosomů v páru • - aneuploidie (trisomie chromosomů 21, 18, 13, gonosomů, • monosomie chromosomu X)- viz základní přednáška •strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní • typy chromosomů – viz základní přednáška Vznik VCA - de novo - poruchy v procesu meiózy (tvorby gamet z primárních oocytů a spermatocytů); během procesu mitózy v embryu (mozaika) - zděděné – potomci rodičů – nosičů balancovaných přestaveb OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno MOŽNOSTI VYŠETŘENÍ GENETICKÉHO MATERIÁLU (v různých typech laboratoří) •vyšetření chromosomů • – metodami klasické cytogenetiky • (G-pruhování chromosomů) • vyšetření celého karyotypu (všech chromosomů) • rozlišovací schopnost nejnižší (do10 Mb – přibližně 1 pruh) • •vyšetření chromosomů, interfázních • jader i izolované DNA • - metodami molekulární cytogenetiky • (vyšetření pomocí fluorescenčně značených sond, PCR) • vyšetření celého karyotypu • vyšetření konkrétních oblastí • rozlišovací schopnost vyšší (až po rozdíly v jednotlivých • nukleotidech – závisí na konkrétní metodě) • •vyšetření izolované DNA • - metody molekulární genetiky • rozlišovací schopnost nejvyšší (rozdíly v sekvenci DNA) 12-8 Zemna tel 11 DNA+ +21 fish dvoušroubovice DNA chromosom s fluorescenčně značenými sondami (vlevo), interfázní jádro (vpravo) chromosom s G-pruhy OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ •postnatální materiály: periferní krev •prenatální materiály: plodová voda, choriové klky, • krev plodu, kůže potracených plodů • kůže, placenta 011 nasazení plodovky 001 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY •odběr materiálu – STERILNÍ ODBĚR! •kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk • (s chromosomy), zastavení dělení buněk kolchicinem •zpracování suspenze (hypotonizace, fixace) – získání suspenze jader •vykapání na podložní sklíčka •pruhování / barvení chromosomů •hodnocení v mikroskopu • metody 1. volby v indikovaných případech OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu • Odběr materiálu pro účely cytogenetického • vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • •do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) •do heparinu a transportního média – kostní dřeň • (obv. 1-2 ml) •do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) •bez přídavku média a dalších látek – plodová voda • (obv. 20 ml) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu •Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které •jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních •chromosomů : •periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty •fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé • T-lymfocyty •plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní • fibroblasty •choriové klky – z chorionu nebo placenty - buňky choriových • klků nebo placenty •kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní • fibroblasty •kostní dřeň – z prsní kosti, kyčlí – prekurzory krevních buněk •solidní tumory – z nádoru – maligní buňky • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu kultivace4 inverzní mikroskop 2 nasazení plodové vody (sterilní podmínky – laminární box) nasazení periferní krve (sterilní podmínky – laminární box) fotky 005 aplikace kolchicinu – mitotického jedu po kultivaci nádory2 024 kultivace v termostatu 1 2 3 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu •délka kultivace • - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) • - 48 hodin (stanovení ZCA) • kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit • 1. buněčné dělení, později dochází k reparaci • chromosomů nebo k zániku buněk s aberací • - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) • - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) • - choriové klky – přes noc (stanovení karyotypu) • - kostní dřeň – přímé zpracování buněk • ihned po odběru • - 24 hodin (48 hodin spec. případy) • (stanovení karyotypu maligních klonů v KD) • - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) • - solidní tumory – minimálně 3 týdny • (stanovení karyotypu maligních klonů v tumoru) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu • •kultivace buněk • v suspenzi (periferní krev, • fetální krev, choriové klky, • kostní dřeň) • • kultivace buněk • přichycených na dně • kultivační nádobky • (plodová voda, solidní • tumory, kůže) • - po kultivaci pomocí • roztoku trypsinu • odloupneme ode dna, dále • zpracováváme • jako suspenzi buněk • kultivace4 inverzní mikroskop 2 kultivace plodové vody kultivace periferní krve OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve •kultivace periferní krve v médiu • s přídavkem phytohemaglutinu (PHA) • = výtažek z fazolu obecného (Phaseolus vulgaris) • - T-lymfocyty = zralé diferencované buňky s malou spontánní mitotickou aktivitou • - vlivem PHA se dediferencují (přeměna na nezralé buňky lymfoblasty, které se dělí (tzn. jádra vstupují do mitózy!) • (např. k nezralým buňkám – blastům z kostní dřeně • onkologických pacientů není třeba PHA přidávat, • dělí se samovolně) • - význam kultivace – spiralizace chromosomů v jádrech • T-lymfocytů • - složení kultivačního média – živné látky, antibiotikum, PHA, • stabilizátor pH • • • • fazole OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY po kultivaci •aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) • - kolchicin je mitotický jed, který specificky • inhibuje dělící vřeténko a tím zastavuje dělení • jader v metafázi mitózy, kdy jsou chromosomy • vhodné k analýze ocún fotky 005 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •hypotonizace, fixace – získání suspenze jader • fotky 044 fotky 190 hypotonizace – buňky přijímají vodu, prasknou erytrocyty, zvětšení objemu jádra T-lymfocytů, rozestoupení chromosomů fixace – rozpuštění cytoplasmy buněk (zůstanou jádra s genetickým materiálem – chromosomy nebo v interfázi), rozpuštění nečistot, fixace buněčných struktur OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • vykapání suspenze jader na podložní sklíčka – chromosomy v jádrech ohraničených jadernou membránou se rozestoupí – na sklíčku se nacházejí mitózy – soubory chromosomů jednotlivých jader a interfázmí jádra • zaschnutí, zapečení přednáška 090 kapání2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G -pruhování chromosomů • G - pruhování chromosomů přednáška 022 přednáška 065 1 – inkubace preparátu v roztoku trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 2 – barvení barvivem Giemsa- Romanowski vznik pruhů na povrchu chromosomů – střídavé světlé a tmavé pruhy různé intenzity OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •chromosomy s G-pruhy hodnotíme ve světelném mikroskopu •zdroj světla - viditelná část spektra (halogenová žárovka) • (stanovení karyotypu) kongo4 přednáška 038 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení zvětšení přibližně 1000x dlouhý2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno přednáška 059 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •světelný mikroskop •s CCD kamerou •napojený na počítač přednáška 054 přednáška 056 ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačové analýzy obrazu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI karyotyp •soubor chromosomů v somatických buňkách jedince, označujeme počet chromosomů, typ pohlavních chromosomů a případné aberace (zápis karyotypu např. 46,XY) • •normální lidský karyotyp se skládá • ze 46 chromosomů - 22 párů • autosomů (nepohlavních chromosomů), • 2 gonosomů (pohlavních chromosomů) • •chromosomový pár je tvořen homologními • chromosomy (jeden zděděn od otce, druhý od matky), nepárové chromosomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) • norm mužský obrázek = utříděný soubor chromosomů jednoho jádra, který vypovídá o chromosomech i v ostatních buňkách pacienta OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY norm mužský OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX norm OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení •Při vyšetření karyotypu analyzujeme větší počet mitóz, •podle požadavku lékaře a nalezené patologie (10, 30, 50, 100). •Ve spolupráci s molekulární cytogenetikou analyzujeme i 200 jader. OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • vykapání suspenze na podložní sklíčka (pro některá vyšetření (FISH)) přednáška 090 kapání2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY princip vazby fluorescenčně značené sondy na chromosomy nebo interfázní jádra na podložním sklíčku sonda značená sonda vazba značené sondy na cílovou DNA (chromosom) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY hodnocení •chromosomy fluorescenčně značené hodnotíme ve fluorescenčním •mikroskopu, zdroj světla - krátkovlnná část spektra (např. rtuťová •výbojka); fluorescenční mikroskop je také součástí systému analýzy obrazu zdroj krátkovlnného vysokoenergetického záření speciální filtry OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno 1045-03 darkyne METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - FISH CEP8 Zemna tel 11 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno NÁVAZNOST METOD KLASICKÉ A MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - metodami molekulární cytogenetiky upřesňujeme a potvrzujeme patologické nálezy detekované metodami klasické cytogenetiky - metody molekulární cytogenetiky odhalí velmi malé změny v karyotypu, které nelze detekovat metodami klasické cytogenetiky (nízká rozlišovací schopnost klasických metod) při vyšetřování - vrozených chromosomových aberací - získaných chromosomových aberací u onkologických pacientů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) - příklady potvrzení přítomnosti balancované translokace v karyotypu metodou FISH Hitra 1151-06wcp 46,XY,t(5;19)(q15;p12) G-pruhování chromosomů metoda FISH OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA • 46,XX,del(5)(p14.1)syndrom Cri du Chat Křížová G-pruhování chromosomů (klasická cytogenetika) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) potvrzení přítomnosti delece v karyotypu metodou MLPA metoda MLPA (metoda molekulární cytogenetiky) – potvrzení nálezu OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní změny – nebalancované aberace mikrodelece (delece menší než rozlišovací schopnost vyšetření chromosomů s G – pruhy) vyšetření metodami molekulární cytogenetiky – vyšší rozlišovací schopnost (FISH) vyšetření metodami klasické cytogenetiky G-pruhování chromosomů 46,XX normální karyotyp 46,XX nalezena delece na 22. chromosomu v oblasti 22q11-13 (Di George syndrom – VSV) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS •má – li osoba chromosomovou abnormalitu, bývá většinou aberace přítomna ve všech jejích buňkách •mozaicismus = v těle jedince jsou přítomny 2 nebo více linie buněk s odlišnou chromosomovou konstitucí • - nejčastější výskyt mozaiky gonosomů (poruchy fertility) • 45,X[6]/47,XXX[4]/46,XX[190] • - mozaika autosomů • - mozaika linie s normálním karyotypem s linií s Downovým syndromem • 47,XY,+21[172]/46,XY[28] • - např. linie s normálním karyotypem s linií s monosomií • chromosomu 18 45,XX,-18[10]/46,XX,r(18)[190] – velmi zřídka •ve formě mozaiky mohou být přítomny numerické aberace i strukturní přestavby, početní se vyskytují častěji •nejčastější příčinou mozaicismu je nondisjunkce v časném postzygotickém mitotickém dělení (např. ztráta chromosomu č.21 • z buňky zygoty s trisomií tohoto chromosomu) • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) DEFINICE MOZAIKY •Jedinec nebo tkáň obsahuje 2 nebo více geneticky odlišných •buněčných klonů pocházejících z jediné zygoty, které vznikly •v důsledku mutace nebo nondisjunkce na různých úrovních •postzygotického dělení (mitotického dělení). • •(Chiméra – buňky jedince pocházejí z více zygot.) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno • 45,X[6]/46,XX[194] •10-30 mitóz hodnotíme z chromosomů s G-pruhy, zbytek vyšetření metodou FISH •z interfázních jader VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy 46,XX 45,X 3% hraniční patologický nález OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - gonosomy Mozaika X • 45,X[6]/46,XX[194] • vyšetření % zastoupení jednotlivých linií buněk v periferní krvi • pacientky metodou FISH z interfázních jader • (3% zastoupení buněčné linie 45,X) 1 signál (přítomen 1 chromosom X v jádře buňky) 2 signály (přítomny 2 chromosomy X v jádře T-lymfocytu) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace 12 letý pacient s diagnózou malý vzrůst Kapitančík1 kap4 buněčná linie 46,X,r(Y)? OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Kapitančík2 1461-08 g foto buněčná linie 46,X,mar(Y)? OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Kapitančík4 1461-08 b foto buněčná linie 46,X,t(Y;9)(p11?;q12?) t(Y;?), přítomna oblast SRY buněčná linie kap1a OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Kapitančík3 1461-08 d foto buněčná linie 45,X OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – kombinace početní a strukturní aberace Karyotyp – chromosomy s G - pruhy: 46,X,r(Y)?[5]/46,X,t(Y;9)(p11.32?;q12?)[4]/45,X[1] Nálezy metodou FISH: Vyšetření na interfázních jádrech: XY [120] X [70] Vyšetření na mitózách: t(Y;?), přítomna oblast SRY [26] X + marker z chromosomu Y, oblast SRY přítomna [17] X [7] složitý zápis i interpretace složitých karyotypů v mozaice OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS - význam •je obtížné posoudit význam nálezu mozaiky • - záleží na typu chromosomové abnormality • - význam má % zastoupení linie s patologickým karyotypem • - % zastoupení jednotlivých buněčných linií může být v různých • tkáních rozdílné (vyšetření z periferní krve, stěru z bukální sliznice • pro ověření a porovnání) • • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VZNIK MOZAIKY (vždy de novo, nedědí se) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno •M fáze buněčného cyklu = MITÓZA •postupná kondenzace chromatinu až do maxima •v metafázi, vznik chromosomů (chromosomy tvořeny •dvěma chromatidami) • •oddělení sesterských chromatid v centromeře v anafázi •(chromosomů je dvojnásobný počet a jsou tvořeny •jednou chromatidou) – podélné dělení centromery • •segregace dceřinných chromatid (samostatných •chromosomů), pohybují se k protilehlým pólům buňky •VZNIK MOZAICISMU - SESTERSKÉ CHROMATIDY •SE NEROZEJDOU K OPAČNÝM PÓLŮM •(abnormální rozchod, mitotická nondisjunkce) • •mitóza je dokončena cytokinezí - rozdělením cytoplazmy •původně mateřské buňky za vzniku dvou dceřinných •buněk, jejichž jádra obsahují stejnou genetickou výbavu •jako buňka mateřská (dělení buňky) • • bun cyklus rozchod k pólům rozchod dceřinných chromatid v anafázi mitózy MITÓZA (proces dělení somatických buněk) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ROZESTUP SESTERSKÝCH CHROMATID V ANAFÁZI MITÓZY an13 an16 vyrez1 vyrez 2 • M fáze = MITÓZA •chromosomy v anafázi mitózy 12-8 an9 průběh rozchodu chromatid metafázní dvouchromatidový chromosom dva jednochromatidové chromosomy OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika •riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu, potíže při interpretaci (kultivace 2 paralelních kultur, opakovaný odběr) •vyšetření choriových klků – extraembryonální tkáň, častý výskyt mozaikových karyotypů (mitotická nondisjunkce) – diskrepance v nálezech u embrya a extraembryonální tkáni (embryo má kontrolní mechanismy limitující dělení abnormálních buněk, v choriu se abnormální buňky dělí) • • • OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika • • • mozaika CVS – diskrepance v karyotypu embrya a extraembryonální tkáně - vznik mozaiky v blastocystě před diferenciací na embryo a extraembryonální tkáň – mozaika přítomna v obou - vznik mozaiky v pozdějším stádiu v embryu nebo v extraembryonální tkáni (častěji) – mozaika přítomna jen tam, kde vznikla placentární mozaicismus – zdroj falešně pozitivních výsledků OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ VCA - objasnit příčinu zdravotních potíží pacienta - stanovit prognózu onemocnění, nabídnout pacientovi možnosti léčby a péče - prevence výskytu vrozených chromosomových aberací v rodině VCA léčbou nevymizí OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ • • kostní dřeň solidní nádory periferní krev dřeň 002 nádory 003 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮ vyšetření v laboratořích klasické a molekulární cytogenetiky klasická cytogenetika – kultivace, zpracování vstupních materiálů založeny na obdobných principech - G-pruhování chromosomů molekulární cytogenetika – metoda FISH, SKY, CGH a další metody stanovujeme KARYOTYP MALIGNÍCH KLONŮ – v nádorové tkáni mohou být přítomny skupiny buněk s odlišným karyotypem – klony – v rámci klonu stejný karyotyp 12-8 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů •početní abnormality •abnormality počtu chromosomových sad (obv. se nejedná o přesný násobek haploidního počtu) • - polyploidie (hypo-, hyper- (di-, tri- atd.) ploidie) •abnormality počtu chromosomů v páru • - aneuploidie (trisomie, monosomie)- často se týká jiných chromosomů než • u vrozených chromosomových aberací • •strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace, inzerce, zvláštní • typy chromosomů – konkrétní aberace odlišné od VCA • amplifikace (mnohonásobné zmnožení onkogenu, detekovatelné cytogeneticky) • – pouze u onkologických pacientů – souvisí se vznikem a progresí onkologického onemocnění (poruchy dělení somatických buněk), vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno kalab-CYTO kalab-SKY ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) smíšený germinální tumor OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (u onkologických pacientů) MOZAICISMUS •nádorové buňky tvoří klony •klon - skupina geneticky identických buněk – • z pohledu cytogenetiky se stejným karyotypem • (v nádorové tkáni pacienta se může vyskytovat více buněčných klonů, každý z nich nese jiné aberace) (stanovení karyotypu maligních klonů) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů U onkologických pacientů vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením, v souvislosti s onemocněním vznikají chromosomové změny. Cytogenetické vyšetření přesněji charakterizuje nádor, typ nalezených aberací vypovídá o prognóze, fázi onemocnění. Pomáhá zpřesnit diagnózu, stanovit prognózu onemocnění, monitorovat úspěšnost léčby. Cílem je záchrana života pacienta. – některé translokace – vznik fúzních genů, jejichž produkty mají změněnou funkci podporující nebo způsobující nádorové bujení - některé chromosomové změny souvisejí s horší/ lepší/ střední prognózou OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí - z periferní krve OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) •vlivem mutagenních faktorů prostředí dochází na chromosomech ke změnám (zlomy, vznik di-, tricentrických chromosomů, ring chromosomů ad.) • – nacházíme různé změny v různých buňkách • (v každé buňce jinou – nejedná se o mozaiku, ale o náhodné změny) (stanovení % aberantních buněk, hraniční patologie opakovaně 5% ab. b.) DIC DF tmavý zlomy1 dic chrb vyšetření z periferní krve metodou klasické cytogenetiky – konvenční barvení chromosomů OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (vliv mutagenních faktorů prostředí) vyšetření z periferní krve • •rychlejší stárnutí organismu •vznik degenerativních onemocnění •možné maligní zvrhnutí • • Přítomnost aberací v somatických buňkách Přítomnost aberací v gametách •zvýšené riziko narození postiženého dítěte Konvenční barvení chromosomů Stanovení % aberantních buněk – buněk s poškozeným chromosomem zlomy1 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA) příčiny vzniku • působení - fyzikálních faktorů • (ionizující záření) • - chemických látek • (cytostatika, imunosupresiva, oxidační, • alkylační činidla ad. látky používané • v průmyslu) • - biologických faktorů • (virové infekce – pravé neštovice, spalničky, • zarděnky ad.) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace označení cht •jednochromatidové gapy (mezery) • (G´nebo chtg – chromatid gap)- příčně slabě se barvící část chromatidy achromatické léze), také úplné přerušení chromatidy nepřesahující její šířku • G světlý sejmout000r OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace označení cht • •jednochromatidové zlomy (Z´nebo chtb – chromatid brake), oddělení samostatného fragmentu (F) – úplné přerušení chromatidy, pravděpodobně koncová delece (fragmenty mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) • sejmout000k Z Z2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace označení cht •výměny (V nebo chte – chromatid exchange)- výměny části chromatid v rámci jednoho nebo více chromosomů • sejmout000z OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromatidové aberace - výměny V V1 V2 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr • •chromosomové zlomy (Z´´nebo chrb – chromosome break), oddělení párových fragmentů (DF)- úplné přerušení obou chromatid, pravděpodobně koncová delece (fragment obvykle leží paralelně, mívají různé rozměry, mohou být v ose s původním chromosomem nebo nemusí) • sejmout000i DF tmavý OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr •chromosomové gapy (mezery) (G´´nebo chrg – chromosome gap)- příčně slabě se barvící část chromosomu (achromatické léze), také úplné přerušení chromosomu nepřesahující šířku chromatidy • sejmout000e G OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr •acentrické ringy, kruhové chromosomy- uzavřené struktury, vznik dvou zlomů na jednom chromosomu, dojde ke spojení – acentrické ringy jsou bez centromery, kruhové chromosomy zahrnují centromeru • • • sejmout000hh R R OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (ZCA)- typ poškození – chromosomové aberace označení chr • •chromosomy zahrnující více než 1 centromeru- • dicentrické, tricentrické chromosomy… • sejmout000dse sejmout000ggg DIC TIC,DF OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno •důležité odlišnosti mezi přípravou preparátů z periferní krve pro: • 1.stanovení karyotypu – chromosomy s G – pruhy • - délka kultivace 72 hodin • - G-pruhování = inkubace v trypsinu + směs barviv Giemsa – • Romanowski • - zajímá nás typ aberace, snažíme se ji co nejpřesněji definovat • •2. stanovení % aberantních buněk – chromosomy konvenčně barvené • - délka kultivace 48 hodin (je třeba zachytit 1. buněčné dělení – • později dochází k opravě aberací) • - konvenční barvení = pouze Giemsa – Romanowski bez trypsinu • - nezajímá nás konkrétní typ aberace, pouze jestli je/není v dané buňce • některá přítomna VROZENÉ ABERACE / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) zlomy1 12-8 OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k vyšetření ZCA (mutagenní faktory) •práce v riziku (kontakt se škodlivými látkami, zářením), vstupní prohlídky na pracovištích se zvýšeným rizikem •před chemoterapií, po chemoterapii, po jiné dlouhodobé léčbě •kontrolní vyšetření u podchycených případů • aberace vymizí po léčbě (vitamíny) OLG_obloha dnbrno logo-FNB logo-MU Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno chromozomy děkuji za pozornost