Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Základy klinické cytogenetiky – chromosomy Hanáková M. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SHRNUTÍ PŘEDNÁŠKY • chromosomy, karyotyp • metody přípravy chromosomových preparátů, hodnocení chromosomů – metody klasické cytogenetiky • vrozené chromosomové aberace • metody molekulární cytogenetiky • onkocytogenetika – získané chromosomové aberace Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY, KARYOTYP Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno SCHEMA LIDSKÉ BUŇKY buněčné jádro (DNA + proteiny, RNA) cytoplasma s organelami (DNA v mitochondriích) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno DEFINICE KLINICKÉ CYTOGENETIKY • klinická cytogenetika zabývá se analýzou chromosomů - počtem - morfologií - vztahem mezi nálezy chromosomových změn a fenotypovými projevy chromosomy = spiralizované molekuly DNA během procesu buněčného dělení - mitózy DNA rozptýlená v buněčném jádře v interfázi buněčného cyklu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno JADERNÝ MATERIÁL • chromatin – komplex DNA s chromosomovými proteiny - pojem lze použít pro jaderný materiál v interfázi - i spiralizované chromosomy jsou tvořeny chromatinem • chromosom – chromatin spiralizovaný v mitóze (mitóza - proces dělení buňky, při kterém dochází k rozdělení genetického materiálu mezi 2 dceřinné buňky) pojmy chromatin a chromosomy - týkají se téhož jaderného materiálu jádro v interfázi mitóza Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMATIN A CHROMOSOMY BĚHEM BUNĚČNÉHO CYKLU kondenzace chromatinu, vznik chromosomů během buněčného cyklu se chromatin nachází v různých fázích spiralizace (v interfázi nízký stupeň spiralizace, během mitózy postupná kondenzace, maximální v metafázi mitózy) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOM V METAFÁZI MITÓZY vláknitá struktura (zaškrcení, konstrikce) chromatida - 1 kontinuální molekula dvouvláknové DNA ve vazbě s chromosomovými proteiny sesterské chromatidy identické kopie molekuly DNA chromatidy chromatidy chromosom s G-pruhy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery • metacentrické chromosomy centromera téměř nebo úplně uprostřed, tedy krátká a dlouhá raménka jsou (téměř) stejně dlouhá • submetacentrické chromosomy centromera mimo střed chromosomu, p a q raménka jsou jasně délkově odlišena Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů podle umístění centromery • akrocentrické chromosomy centromera je umístěna velmi blízko jednomu konci; od krátkých ramének jsou odškrceny satelity (malé výrazné části chromatinu); místo odškrcení = sekundární konstrikce (tenké stopky); (sekundární konstrikce obsahuje kopie genů kódujících rRNA = organizátor jadérka) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI třídění chromosomů do skupin podle velikosti a pozice centromery normální mužský karyotyp 46, XY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI karyotyp • zhodnocený a utříděný soubor chromosomů jedince nebo buňky, označujeme počet chromosomů, typ pohlavních chromosomů a případné aberace • lidský karyotyp se skládá ze 46 chromosomů, z toho 22 párů autosomů (nepohlavních chromosomů) a 2 gonosomů (pohlavních chromosomů) • chromosomový pár je tvořen homologními chromosomy, z nichž jeden je zděděn od otce a druhý od matky, nepárové chromosomy jsou nehomologní (somatické diploidní buňky) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÁPIS KARYOTYPU 46,XX - normální ženský karyotyp 46,XY - normální mužský karyotyp počet chromosomů v jádrech buněk jedince typ pohlavních chromosomů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMY V PRAXI normální karyotyp normální mužský karyotyp 46,XY normální ženský karyotyp 46,XX Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno HISTORIE KLINICKÉ CYTOGENETIKY klasické metody analýzy • vznik moderní lidské cytogenetiky - datuje se od roku 1956, kdy byl stanoven počet lidských chromosomů a byly vyvinuty efektivní metodiky analýzy chromosomů • klasická konvenční metoda barvení chromosomů (chromosomy obarveny po celé délce – lze třídit chromosomy podle velikosti a polohy centromery) • pruhovací metody (1968-70) (proužky na chromosomech, které umožňují individuální rozlišení jednotlivých chromosomů a chromosomových změn) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY PŘÍPRAVY CHROMOSOMOVÝCH PREPARÁTŮ, HODNOCENÍ CHROMOSOMŮ - metody klasické cytogenetiky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY - metody 1. volby v indikovaných případech - relativně levné metody (ve srovnání s metodami molekulární cytogenetiky) • odběr materiálu • kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk, v nichž dochází ke spiralizaci chromosomů • zpracování suspenze buněk • nakapání suspenze na mikroskopická sklíčka • pruhování / barvení chromosomů na sklíčcích Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno odběr materiálu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu choriové klky periferní krev nebo krev plodu plodová voda Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu kostní dřeňkůže potracených plodů solidní nádor Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu odběr materiálu pro účely cytogenetického vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu • do heparinu a transportního média – kostní dřeň • do transportního média – solidní tumory, kůže, choriové klky • bez přídavku média a dalších látek – plodová voda Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno kultivace Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení do kultivačního média sterilní práce v laminárním boxu !!!!!!!STERILNÍ PROSTŘEDÍ!!!!!!! nasazení periferní krve nasazení plodové vody Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu – v termostatu při 37°C - délka kultivace se liší v závislosti na typu materiálu a vyšetření (bez kultivace (kostní dřeň), 72 hodin (periferní krev), přibližně 10 dnů (plodová voda)) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY aplikace kolchicinu po kultivaci • aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) - zastavení dělení buněk v metafázi mitózy jaderný materiál zůstane spiralizován ve formě chromosomů, které jsou vhodné k analýze Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno zpracování suspenze buněk Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • hypotonizace lýza erytrocytů, zvětšení objemu T - lymfocytů, rozestoupení chromosomů v důsledku působení hypotonického roztoku přídavek roztoku KCl (periferní krev) inkubace hypotonizační směsi v termostatu 37°C Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze • fixace – získání suspenze - kyselina octová (1) : metanol (3) - odvodnění buněk, zviditelnění struktury a zlepšení barvitelnosti chromosomů, rozrušení cytoplasmy buněk, rozpuštění nečistot Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze – rekapitulace kroků 1- vzorek po kultivaci a centrifugaci 2 – po hypotonizaci a centrifugaci 3 – po fixaci a centrifugaci (přídavek fixativu 3x) 4 – výsledná suspenze T - lymfocytů 1 2 3 3 3 4 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno nakapání suspenze na mikroskopická sklíčka Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nakapání suspenze na sklíčka sklíčka zasychají při pokojové teplotě ve vodorovné poloze Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno pruhování chromosomů (konvenční barvení chromosomů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G - pruhování chromosomů G - pruhování chromosomů 2 – barvení barvivem Giemsa – Romanowski - A A 1 - inkubace preparátu v roztoku enzymu trypsinu (natrávení chromosomových proteinů) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G - pruhování chromosomů G-pruhování chromosomů analýza karyotypu, karyotypu maligních klonů chromosomy s G – pruhy – střídavé tmavé a světlé proužky různé tloušťky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G - pruhování chromosomů G – pruhování chromosomu č. 1 – vzor (idiogram) a reálný chromosom Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY konvenční barvení chromosomů barvení v barvivu Giemsa – Romanowski (vynecháme inkubaci v trypsinu) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno hodnocení karyotypu – souboru chromosomů v buňkách Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu při zvětšení přibližně 1250x za použití imersních objektivů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení světelný mikroskop s CCD kamerou napojený na počítač ke třídění chromosomů a sestavení karyotypu lze využít počítačového programu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotyp sestavený na počítačovém programu Lucia Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ • postnatální materiály: periferní krev, kůže • prenatální materiály: plodová voda, choriové klky, krev plodu, kůže potracených plodů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) • významně se podílejí na mnoha případech poruch reprodukce, vrozených malformací, mentálních retardací • cytogenetické poruchy jsou přítomny přibližně u 0,6% živě narozených dětí Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (ABERACE) • vrozené chromosomové aberace (VCA) (vyšetření karyotypu) – početní - strukturní Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů • abnormality počtu chromosomů - polyploidie – zmnožení počtu chromosomových sad (1 sada = 23 chromosomů) – pouze u potracených plodů - aneuploidie – nejčastější a klinicky velmi významný typ chromosomových poruch - abnormality počtu chromosomů v páru (normální počet chromosomů v páru = 2, abnormální nejčastěji 3 nebo 1) - tento stav je vždy spojen s poruchou fyzického nebo mentálního vývoje Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie • trisomie – nejčastější porucha (přítomnost nadbytečného chromosomu v páru) trisomie autosomů - (trisomie celého chromosomu je jen vzácně slučitelná se životem) - Downův syndrom 47,XX,+21 (47,XY,+21) - Edwardsův syndrom 47,XX,+18 (47,XY,+18) - Patauův syndrom 47,XX,+13 (47,XY,+13) trisomie gonosomů - (fenotypové důsledky jsou méně závažné než u trisomie autosomů) - Klinefelterův syndrom 47,XXY (muž) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu autosomů Downův, Edwardsův a Patauův syndrom Downův syndrom 47, XX, +21 Edwardsův syndrom 47, XY, +18 Patauův syndrom 47, XY, +13 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu gonosomů Klinefelterův syndrom Klinefelterův syndrom 47,XXY Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) abnormality počtu chromosomů aneuploidie • monosomie – méně častá porucha (chybění 1 chromosomu v páru) - monosomie gonosomu X (Turnerův syndrom) 45,X (žena), častý výskyt Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • strukturní abnormality chromosomů • méně časté než aneuploidie • dochází k přestavbám a následně ke změnám morfologie chromosomů • předpokladem je vznik zlomů na chromosomech Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby • balancované přestavby - v sadě chromosomů je zachováno normální množství chromosomového materiálu (žádný materiál nechybí ani nepřebývá) - většinou nemají fenotypové vyjádření (nejsou přítomny poruchy fyzického nebo mentálního vývoje), v buňkách je přítomen veškerý chromosomový materiál, i když v odlišném uspořádání • nebalancované přestavby – část chromosomového materiálu v karyotypu chybí (parciální, částečná monosomie) a (nebo) část přebývá (parciální trisomie) - většinou dochází k fenotypovým abnormalitám Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, balancované translokace • translokace – nejčastější ze strukturních aberací, předpokladem je vznik dvou zlomů, každý na jednom chromosomu výměny segmentů mezi dvěma chromosomy Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace translokace u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet a s tím souvisejících potratů nebo narození potomků s nebalancovaným karyotypem (parciální monosomie jednoho a parciální trisomie druhého chromosomu) rodiče normální fenotyp, matka nositelka translokace dítě postižené, po matce zdědilo 1 derivovaný chromosom pocházející z translokace Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby translokace 46,XX,t(16;21)(q22;q22.1) 46,XY,der(21)t(16;21)(q22;q22.1) rodič dítě Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, balancované inverze • inverze – na jednom chromosomu vzniknou 2 zlomy, segment mezi nimi se otočí o 180° a opět se začlení do chromosomu inverze u svých nositelů většinou nezpůsobují abnormální fenotyp, ale jsou spjaty s vysokým rizikem vzniku nebalancovaných gamet a narození abnormálních potomků Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby, nebalancované delece • delece – vznik zlomů a ztráta úseku chromosomu, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální monosomie) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE (VCA) strukturní přestavby duplikace • duplikace – nadbytečný chromosomový segment, který způsobuje vznik nebalancovaného karyotypu (parciální trisomie) - bývají méně nebezpečné než delece - vznik de novo v důsledku nerovnoměrného crossing overu duplikace segmentu dup(6) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÁPIS KARYOTYPU 47,XX,+21 46,XX,t(8;21) nadbytečný autosom v jádrech buněk (početní změna) 45,X 47,XXY chybějící nebo nadbytečný gonosom v karyotypu (početní změna) inverze v karyotypu (strukturní změna) Příklady patologických karyotypů: 46,XX,inv(1) 46,XX,del(5) translokace v karyotypu (strukturní změna) delece v karyotypu (strukturní změna) 46,XX,dup(6) duplikace v karyotypu (strukturní změna) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k postnatálnímu stanovení karyotypu • problémy časného růstu a vývoje neprospívání, opoždění vývoje, dysmorfická facies, mnohočetné malformace, malá postava, obojetný genitál, mentální retardace • narození mrtvého plodu a úmrtí novorozence výskyt chromosomových abnormalit je vyšší u případů narození mrtvého plodu (téměř 10%) než u živě narozených dětí (asi 0,6%), zvýšený výskyt také u dětí, které umírají v novorozeneckém období (okolo 10%) • problémy s fertilitou ženy s amenoreou, infertilní páry, opakované spontánní aborty, partneři před IVF • rodinná anamnéza známá nebo suspektní chromosomová abnormalita u příbuzných • dárci gamet, děti k adopci Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Klinické indikace k prenatálnímu stanovení karyotypu (karyotypu plodu) invazivní metody vyšetření karyotypu plodu jsou indikovány – při vyšším riziku narození dítěte s VCA (vrozenou chromosomovou aberací) - patologické hodnoty biochemických markerů z krevního séra matky (screening I., II. trimestru) - VVV nalezené na UZ (screening I., II. trimestru) - balancovaná VCA u rodičů nebo v rodině - výskyt VCA v rodině - předchozí porod dítěte s VCA - po umělém oplodnění (IVF – in vitro fertilizace) - věk matky – 35 let v roce porodu - pouze vyšší věk není indikací k vyšetření - věk otce – nad 40 let (riziko vyššího výskytu monogenních chorob) - II - součet věku rodičů – nad 70 let - pouze vyšší věk není indikací k vyšetření Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY, příklady využití v klinické cytogenetice Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • molekulární cytogenetika aplikuje metody molekulární biologie na cytogenetické úrovni, vizualizuje a lokalizuje genetický materiál v buňkách • pracuje s metafázními chromosomy nebo interfázními jádry • potvrzuje a upřesňuje nálezy klasické cytogenetiky (metody klasické cytogenetiky – základní vyšetřovací metody, metody molekulární cytogenetiky – speciální metody s vyšší rozlišovací schopností, některé detekují pouze specifické úseky genetického materiálu, jiné vyšetří celý genetický materiál) • začátek rozvoje – přelom 60.- 70. let 20. století • metodami klasické cytogenetiky (ve světelném mikroskopu) lze na chromosomech rozlišit strukturní změny pouze o určité velikosti (>5Mb) • změny menší lze detekovat metodami s vyšší rozlišovací schopností – metodami molekulární cytogenetiky Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY • molekulárně cytogenetickými technikami nelze nahradit klasické karyotypování (před použitím metod molekulární cytogenetiky je třeba vědět, co chceme hledat – při klasickém karyotypování vidíme karyotyp jako celek za relativně nízkou cenu, vysoká cena molekulárně cytogenetických metod) • oblasti uplatnění FISH – klinická cytogenetika (postnatální vyšetření u sterilních párů, postižených dětí a dospělých s podezřením na genetickou příčinu onemocnění, genetická analýza pro účely umělého oplodnění, prenatální diagnostika karyotypu plodu) - nádorová cytogenetika - výzkum (evoluční studie karyotypu, mapování genomu ...) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) fluorescenční in situ hybridizace (FISH) je metoda umožňující přesnou detekci a lokalizaci specifických úseků DNA na chromosomech nebo v interfázním jádře pomocí vazby specifických krátkých molekul DNA - sond, které jsou značeny fluorescenční značkou. in situ – na původním místě (cílový úsek vizualizujeme na původním místě na chromosomu nebo v interfázním jádře – pozorujeme na podložním sklíčku ve fluorescenčním mikroskopu; (DNA analýza – izolujeme DNA, konkrétní úseky namnožíme (amplifikace), analyzujeme odděleně od ostatního genetického materiálu - jen část genu)) sonda (molekula DNA) fluorescenční značka Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY - FISH (fluorescenční in situ hybridizace) vazba sondy (próby) k cílovému místu na chromosomu nebo v interfázním jádře. – signál pozorujeme ve fluorescenčním mikroskopu, barevné záření vypovídá o místě vazby sondy sonda před naznačením fluorescenční značkou značená sonda vazba sondy na cílovou DNA v místě navázání sondy pozorujeme fluorescenční záření Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – FISH (fluorescenční in situ hybridizace) • vyhodnocení a zpracování signálu – FISH - fluorescenční mikroskop napojený na počítač – vizualizace a kvantifikace (signál září v tmavém poli) – modrá barvička (DAPI) obarvuje všechny chromosomy, červený, zelený signál = fluorescenčně značená sonda FISH na metafázních chromosomech FISH na interfázních jádrech trisomie chromosomu 21 (Downův syndrom)potvrzení přítomnosti translokace v karyotypu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH • složitější metody, které vypovídají o změnách v genetickém materiálu v celém karyotypu (nejen v jednotlivých specifických úsecích), které jsou detekovatelné na cytogenetické úrovni • pracují se směsí sond, která je specificky připravená pro danou metodu Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – CGH (komparativní genomová hybridizace) zeleně označeny úseky na chromosomech, které jsou v karyotypu maligního klonu zmnoženy, červeně označeny chybějící úseky chromosomů (obrázky převzaty z internetu) metoda odhaluje nebalancovaný genetický materiál (chybění – nadbytek DNA) - systém fluorescenční mikroskop – kamera – počítač, analyzační software měří poměr fluorescence při vlnových délkách odpovídajících červenému a zelenému fluorochromu celogenomová sonda bez patologie celogenomová sonda z DNA pacienta Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – SKY (spektrální karyotypování), M-FISH (multicolor FISH) SKY – mitóza po hybridizaci se směsí sond značených fluorochromy SKY – seřazené chromosomy po úpravě obrazu objasnění složitých přestavech směs sond, které barevně odliší genetický materiál jednotlivých chromosomových párů Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno METODY MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKY – MODIFIKACE FISH – M-BAND (mnohobarevné pruhování) přestavby v rámci jednoho chromosomu (inverze, delece) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA - získané chromosomové aberace Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA základy • zhoubné bujení je genetické onemocnění • vznik nádoru (maligní transformace) je mnohastupňový proces – zahrnuje sled genetických změn – mutace genů řídících buněčné dělení, růst a diferenciaci, buněčný zánik, reparaci DNA, přestavby na úrovni chromosomů a genomu, narušení integrity genomu (defekty v genech zajišťujících chromosomovou stabilitu a přesný rozchod chromosomů v mitóze) • maligní buňky mají během vývoje nádoru tendenci akumulovat chromosomové abnormality • chromosomové přestavby u onkologických pacientů, které vznikají v průběhu progrese onemocnění, řadíme k získaným aberacím (nikoli vrozeným) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA protoonkogeny - onkogeny • protoonkogeny – normální geny přítomné ve všech buňkách, jsou zahrnuty do procesů regulace buněčné proliferace (buněčného dělení, růstu a diferenciace) a reparace (opravy) DNA • onkogeny – mutované („aktivované“) alely protoonkogenů, mutace vede k zisku funkce nebo změně funkce (atypická aktivace). Usnadňují maligní transformaci. K aktivaci dochází v důsledku mutace. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA tumor supresorové geny • tumor supresorové geny (antionkogeny) – normální buněčné geny, jejichž funkcí je zabraňovat nekontrolovanému dělení buněk. Jejich onkogenicita se projeví při ztrátě funkce (inaktivaci) obou alel genu. K inaktivaci dochází většinou v důsledku delece. Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ kostní dřeň solidní nádory periferní krev Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VYŠETŘENÍ CHROMOSOMŮ vyšetření v laboratořích klasické a molekulární cytogenetiky klasická cytogenetika – kultivace, zpracování vstupních materiálů založeny na obdobných principech - G-pruhování chromosomů molekulární cytogenetika – metoda FISH, SKY, CGH a další metody stanovujeme KARYOTYP MALIGNÍCH KLONŮ – v nádorové tkáni mohou být přítomny skupiny buněk s odlišným karyotypem – klony – v rámci klonu stejný karyotyp Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ZÍSKANÉ CHROMOSOMOVÉ ABERACE u onkologických pacientů • početní abnormality • abnormality počtu chromosomových sad (obv. se nejedná o přesný násobek haploidního počtu) - polyploidie (hypo-, hyper- (di-, tri- atd.) ploidie) • abnormality počtu chromosomů v páru - aneuploidie (trisomie, monosomie)- často se týká jiných chromosomů než u vrozených chromosomových aberací • strukturní abnormality • translokace, inverze, delece, duplikace a další změny – konkrétní aberace odlišné od VCA • amplifikace (mnohonásobné zmnožení onkogenu, detekovatelné cytogeneticky) – pouze u onkologických pacientů – souvisí se vznikem a progresí onkologického onemocnění (poruchy dělení somatických buněk), vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn • chromosomové změny – početní - chybění nebo nadbytek chromosomů v páru – (typické jsou abnormality jiných chromosomů než u VCA) - aneuploidie 47,XX,+845,XX,-7 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn - chybění nebo nadbytek většího počtu chromosomů • chromosomové změny – početní - polyploidie – násobek počtu chromosomových sad – často sady nejsou kompletní - hypo - diploidie - hyper - triploidie… Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn • chromosomové změny - strukturní často typické změny pro určité typy nádorů (jiná místa zlomů než u VCA) – translokace – nejznámější translokace t(9;22) – Ph chromosom (Philadelphský chromosom) u chronické myeloidní leukemie (CML) - inverze - delece - amplifikace - v buňce je přítomno mnoho kopií genu (normální počet genů na 1 chromosomu je 1) (tato změna se nevyskytuje u VCA, je typická pro onkologická onemocnění) mnohokrát zmnožený onkogen sonda označující počet chromosomů, na kterých je gen lokalizován (centromera) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn • kombinace početních a strukturních chromosomových změn početní změny chromosomů translokace chromosomů strukturní změny Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA komplexní karyotyp 56,XY,der(X)t(X;5),+der(1),add(2),+3,der(4)t(4;?),+6?,+8, +10,der(11),+der(11)t(11;21)?,+der(11),+der(12)t(7;12) qdp(12p),+17,der(18) smíšený germinální tumor Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno ONKOCYTOGENETIKA typy chromosomových změn nahromadění více chromosomových změn v karyotypu = KOMPLEXNÍ KARYOTYP (charakteristický znak zhoubných nádorů zvláště v pozdějších stádiích progrese nádoru) Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno VÝZNAM VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ u onkologických pacientů U onkologických pacientů vyšetřujeme buňky postižené nádorovým bujením, v souvislosti s onemocněním vznikají chromosomové změny. Cytogenetické vyšetření přesněji charakterizuje nádor, typ nalezených aberací vypovídá o prognóze, fázi onemocnění. Pomáhá zpřesnit diagnózu, stanovit prognózu onemocnění, sledovat úspěšnost léčby a průběh onemocnění, zvolit léčebný postup. Cílem je záchrana života pacienta. – některé translokace – vznik fúzních genů, jejichž produkty mají změněnou funkci podporující nebo způsobující nádorové bujení - některé chromosomové změny souvisejí s horší/ lepší/ střední prognózou Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Doporučená literatura • Klinická genetika, Thompson 2001 • Základy klinickej genetiky, Sršeň, Sršňová 1995 • Základy lékařské genetiky, Pritchard, Korf 2003 Vytvořilo Oddělení lékařské genetiky FN Brno Děkuji za pozornost