Nádorové (tumorové) markery Petr Breinek BC_TM_N2011 Definice ØŠiroké spektrum molekul (většinou proteinů) rozdílných vlastností, které se vyskytují se ve zvýšené koncentraci v nádorových tkáních nebo v krvi onkologických nemocných ØMohou být produkovány nádorovými buňkami (s nádorem asociované antigeny) nebo jinými tkáněmi jako jejich odpověď na maligní proces (indukované TM) Jaký je význam stanovení TM? ØSledování efektu terapie/průběhu choroby ØNávrat choroby (remise) ØUpřesnění diagnózy ØUrčení prognózy ØPodezření na reziduální nádor Negativní nález neznamená nepřítomnost nádoru Ø Universální tumorový marker, který by jednoznačně určil, zda jedinec má nebo nemá nádorovou chorobu není zatím znám Ø Nádorová onemocnění (rakovina) ØDruhá nejčastější příčina úmrtí ØV průběhu života onemocní v ČR rakovinou každý třetí a každý čtvrtý na ni zemře ØVyléčí se asi 47% nemocných (63% Island a Švédsko) ØLéčba v komplexních onkologických centrech Nádorové buňky ØNekontrovatelný růst určité části buněčné populace ØZměny v genomu/ enzymovém systému Ø ØJsou narušeny kontrolující a řídící mechanismy pro normální růst Vývoj maligního nádoru a jeho zachycení 1 µg 1 mg 1 g 10-100 g 1 kg HMOTNOST NÁDORU 103 106 109 1010-1011 1012 POČET NÁDOROVÝCH BUNĚK Preklinické stadium Diagnostický práh Včasná diagnóza Pozdní diagnóza Rozdělení nádorů ØBenigní (nezhoubné) ØMaligní (zhoubné) Ø - karcinomy (epiteliální nádory) Ø - sarkomy (mesenchymální původ) Ø - hematologické nádory Ø - metastázy Ø (druhotné ložisko maligního nádoru) - Třídění tumorových markerů (podle výskytu) 1.Humorální (prokazované v krvi nebo jiných tělesných tekutinách) 2. 2.Celulární (buněčné, vyskytují se v nádorových buňkách nebo na jejich povrchu) Třídění tumorových markerů (podle biologické funkce) Ø1. Onkofetální a onkoplacentární antigeny (CEA,AFP, hCG) Ø Onkofetální antigeny – látky vytvářené organismem ve fetálním období(po narození se tvoří jen v souvislosti s nějakým onemocněním, nejčastěji nádorem) Ø Ø2. Karbohydrátové molekuly s epitopy rozpoznávané pomocí mAb (CA=carbohydrate antigen, CA125, CA 15-3, CA 19-9, CA 72-4) Ø3. Proliferační a diferenciační antigeny (TPS, PSA) Ø4. Hormony (hCG, ACTH, parathormon, kalcitonin) Ø5. Enzymy (NSE, TK, LD) Ø6. Specifické proteiny (ferritin, monoklonální imunoglobuliny/ paraproteiny) Ø Ø Ø7. Receptory (estrogenové, progesteronové) Ø8. Metabolity (metanefriny, katecholaminy) Ø9. Onkogeny a onkoproteiny (p53, BRCA1) Ø Ø Gen buněčného nebo virového původu zodpovědný za rychlý a nekontrolovaný růst živočišných buněk (mutovaný gen) Ø Vznikne z protoonkogenu, který po aktivaci je schopen vyvolat neoplastickou transformaci Metody stanovení TM Ø1. Imunoanalytické metody Ø2. Stanovení enzymů Ø3. Metody chromatografické Ø4. Metody molekulární biologie Ø Doporučená přesnost stanovení ØOpakovatelnost (přesnost v sérii): <5% ØMezilehlá přesnost: <10% Ø Další metody používané pro diagnostiku nádorů Ø Patologie Ø Histologie Ø Cytologie Ø Imunohistochemie Ø Průtoková cytometrie Ø Biofyzikální (rtg, CT, Sono, PET) ØMetody molekulární biologie Ø PCR, DNA mikroarray, proteomika 1.Imunoanalytické metody Ø Ø Principem je vazba mezi antigenem (TM) a k němu specifickou protilátkou (Ab) získanou imunizací nebo synteticky, případně rekombinantně (monoklonální protilátky,mAb) Ø Nejčastěji používané principy IA Ø Øa) Fluorescenční metody Ø (FIA, FPIA, DELFIA, TRACE, ..) Øb) Enzymová imunoanalýza, EIA Ø (EMIT, ELISA, MEIA, CEDIA, ..) Øc) Luminiscenční imunoanalýza Ø (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,..) Standardizace imunoanalytických metod na stanovení TM je nízká ØPříčiny: üNízká specifita používaných protilátek,které jsou orientované proti nestejným epitopům üAntigen existuje ve více izoformách üInterference Ø Frekvence vyšetření TM ØPřed nasazením terapie ØPo skončení terapie Ø1 měsíc v prvním roce po primární terapii Ø2 měsíce ve druhém roce Ø3 měsíce v dalších letech sledování Øpři změně terapie ØPři nejasném průběhu nemoci Biologický poločas (TM) v séru Marker Poločas Marker Poločas CEA 14d CA 125 4d TPA 7d PSA 2d CA 15-3 7d TK 2d AFP 5d hCG 1d CA 19-9 5d SCC 0,3h Vyjadřování výsledků ØKoncentrace TM v krvi jsou velmi nízké ØVětšina TM vykazuje heterogenitu ØNeexistuje certifikovaný referenční materiál Ø Jednotky koncentrace: Ø Látkového množství (ug/l a ng/l) Ø Biologická nebo imunologická aktivita (U/l, kU/l) Ø Referenční rozmezí ? ØCut-off (rozhodovací limit) Ø Je to koncentrační hladina markeru, pod kterou leží většina hodnot zdravých lidí. Ø Klinická specifita Ø Udává procento správně negativních výsledků ze souboru zdravých. Ø Ø Čím vyšší specifita, tím je méně falešně pozitivních výsledků. Doporučení: >95% Klinická sensitivita (citlivost) Ø Udává procento správně pozitivních výsledků ze souboru nemocných. Ø Ø Čím vyšší sensitivita, tím je méně falešně negativních výsledků. Doporučení: >50% pre23 Klinické hodnocení nádorových markerů zdraví nemocní koncentrace Rozhodovací limit Ideální stav 100% specifita 100% senzitivita Klinické hodnocení nádorových markerů zdraví nemocní koncentrace Rozhodovací limit Falešně negativní Falešně pozitivní TM hodnoceni2 Významné změny hladin nádorových markerů ØBez terapie Ø výrazný nárůst koncentrace ve třech následujících odběrech ØBěhem terapie Ø nárůst o >25% progrese onemocnění Ø pokles o >50% částečná remise ØMatematicko-statistické postupy Diagnostické využití Typ nádoru Hlavní Vedlejší Tlusté střevo, rektum CEA, CA19-9 Žaludek CEA,CA72-4 CA19-9 Pankreas CA19-9, CEA CA125 Prs CA15-3, CEA CA125, TPS Ovarium CA125,CA19-9 CA72-4 Děloha SCCA, CA125 CEA Diagnostické využití Typ nádoru Hlavní Vedlejší Plíce (malobuněčný) NSE, CEA TPS Plíce (nemalobuněčný) CYFRA 21-1 SCC Germinální nádory hCG, AFP NSE Játra AFP, CA19-9 CEA Močový měchýř TPA,TPS CYFRA 21-1 Prostata PSA, FPSA Hematoonkologické TK, B2M paraprotein Zvýšené hodnoty můžeme nalézt také: ØU nemaligních onemocnění(hyperplázie prostaty-PSA) ØPo vyšetřovacích zásazích(rektální vyšetření prostaty-PSA) ØPo chirurgickém zákroku(CA 19-9, CA 125) ØPo kontaminaci analyzovaného materiálu(sliny-SCCA) ØPři akutní terapii(chemoterapie, radioterapie-TPS) ØInterference (hemolýza-NSE) ØKouření (CEA), těhotenství (hCG) ØOnemocnění ledvin a jater Možnost zvýšení hodnot TM u benigních onemocnění TM Nemaligní onemocnění Jiná příčina CEA Zánětlivé choroby jater, jaterní cirhóza, pankreatitida Kouření AFP Zánětlivé procesy plic, GIT, jaterní cirhóza, akutní a chronická hepatitida TPA Infekční procesy, jaterní cirhóza, pankreatitida CA15-3 Jaterní cirhóza, akutní hepatitida, postižení ledvinných glomerulů CA125 Ovariální cysty, choroby jater, pankreatu, žlučníku Těhotenství (1.trimestr) CA19-9 Jaterní cirhóza, cholelithiáza, chronická hepatitida, akutní a chronická pankreatitida,choroby žlučových cest, diabetes hCG Mola hydatidóza Těhotenství B2M Postižení ledvin Ferritin Záněty obecně, poruchy metabolizmu železa CYFRA21-1 Choroby urologického traktu, myomy/ovariální cysty Enzymy ØLD (laktátdehydrogenáza) ØNSE (nespecifická enoláza) ØPSA (prostatický specifický antigen) ØTK (thymidinkináza) ØACPP (prostatická kyselá fosfatáza) ØTumor M2-PK (izoenzym pyruvátkinázy) PSA (prostatický specifický antigen) ØFyziologicky syntetizován v epitelu prostaty u zdravých osob, ve zvýšené míře u nemocných s hyperplázií a s ca prostaty. ØGlykoprotein (10% sacharidů), působí jako serinová proteáza ØVyskytuje se ve volné formě (FPSA) a ve formě komplexů (PSA-AMG a PSA-ACT) ØAMG=alfa2-makroglobulin ØACT=alfa1-antichymotrypsin PSA (prostata specifický antigen) ØZvýšené hodnoty: Ø Benigní hyperlázie prostaty (BHP) a maligní hypertrofie prostaty (ca prostaty) ØNespecifické zvýšení: Ø záněty prostaty (prostatitidy), mechanické dráždění prostaty (vyšetření „per rectum“, jízda na kole) ‹#› 37 37 Volný PSA (FPSA) nZvýšená specifita vyšetření nPoměr FPSA/PSA n pro „šedou zónu“ PSA 4-10 μg/l n0-15% malignita n15-25% malignita i benigní hyperlazie nnad 25% benigní hyperplazie n n Onkofetální antigeny ØAFP ØCEA AFP (alfa fetoprotein) ØSyntetizován již během vývoje plodu, mizí po porodu. Hlavním zdrojem jsou fetální játra. ØGlykoprotein (4% sacharidů) podobný albuminu, popsán 1963 ØRůzné molekulové varianty lišící se v glykosylaci ØProf.MUDr. J. Masopust Dr.Sc. AFP (alfa fetoprotein) ØSoučást screeningu vrozených vývojových vad (v 2. trimestru) ØZvýšené hodnoty: Ø - ca hepatocelulární, testes, ovaria, žaludek, pankreas ØNespecifické zvýšení: Ø hepatitidy, fyziologicky v graviditě, fetální abnormality, alkoholismus,cirhóza a selhání jater CEA (Karcinoembryonální antigen) ØFyziologicky je syntetizován již během vývoje plodu. Hlavním zdrojem je povrch sliznic převážně v gastrointestinálním traktu a v pankreatu. ØGlykoprotein (50% sacharidů, 641 AK) ØRůzné molekulové varianty lišící se v glykosylaci, existuje >36 variant, ovlivňuje buněčnou adhezi CEA ØZvýšené hodnoty: Ø - kolorektální ca, ca žaludku, ca pankreatu, ca plic,prsa,játra ØNespecifické zvýšení: Ø jaterní cirhóza, pankreatitida, kuřáci, alkoholismus, zánětlivé střevní, plicní a žaludeční onemocnění, hepatitidy, autoimunní choroby Fragmenty komplexních glykoproteinů,jejichž epitopy jsou rozpoznávané monoklonálními protilátkami ØCA19-9 (také GI-CA, GI-MA) ØCA15-3 ØCA125 ØCA72-4 Fragmenty cytokeratinů ØTPS ØTPA ØCYFRA21-1 Monoklonální imunoglobuliny Ø ØParaproteiny Ø abnormální imunoglobuliny produkovány proliferujícím klonem plazmatických buněk, případně B-lymfocytů Ø ØVolné lehké řetězce Ø (Bence-Jonesova bílkovina v moči) Hormony a jejich metabolity ØhCG ØPTH ØACTH ØKalcitonin ØGastrin ØProlaktin ØNorepinefrin Øepinefrin Tkáňové markery Ø Molekuly receptorové povahy ØEstrogenový receptor ØProgesteronový receptor Ø (Steroidní receptory, markery ca prsu, pozitivita je indikací k terapii antiestrogeny) ØReceptor pro IL-2 ØC-erb-B2, … Záměry onkologického programu ØSnížit výskyt a úmrtnost na nádorové onemocnění ØZlepšit kvalitu života onkologicky nemocných ØRacionalizovat náklady na diagnostiku a léčbu rakoviny ‹#› 49 49 Závěr n n Nádorové markery nelze přeceňovat, n ale ani zatracovat. n n Budoucnost •Mikročipové technologie •Genomová a proteomová analýza •Vysokorozlišovací dvojrozměrná elektroforéza •Hmotová spektrometrie