Analýza exprese microRNA MUDr. Mgr. Marek Mráz, PhD University of California-San Diego a CEITEC MU 3/13 Moderní metody analýzy genomu LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Lékařská fakulta MU FN Brno_modra_ctverec mosseb ppt horizontal modra 1 qkrátké RNA molekuly ~22 nukleotidů qkomplementární vazba k cílové mRNA qinhibují translaci a snižují stabilitu mRNA q microRNA (miRNA)‏ microRNA DNA mRNA PROTEIN •Lidské miRNA geny: cca 2000 c-elegans_esa memories_l Stovky evolučně konzervovaných microRNA Obrázek1.png Mraz et al., 2010 2 courtesy of F. Slack 3 4 nrc1840-f1.jpg microRNA DNA mRNA PROTEIN mRNA neznamená, že v buňce bude i protein Historicky vždy velká neshoda mezi daty z expresních čipů a expresí proteinů (Western Blot) 5 Specifika analýzy exprese microRNAs: ovelmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond omalé zastoupení ve vzorku – separace microRNA ov lidském genovu cca 2000 genů oněkteré mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt opre-miR, pri-miR, mature-miR omálo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků ozatím málo zkušeností a standardizace o o o q qIsolace qMicroarrays qIdentifikace miRNA (deep sequencing, cloning a Northern blot) qReal-Time PCR q o 6 1/ Izolace a stabilita microRNA Problémy: velikost 22nt, celkově cca 0,01% z celkové RNA Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Obohacení: PAGE FlashPAGE Fractionator (Ambion) Mraz et al., 2009 7 Izolace: TRIzol/TriReagent miRvana (Ambion) PureLink (Invitrogen) a další Mraz et al., 2009 Izolace: TRIReagent/TRIzol is the „gold standard“ (Mraz et al., 2009) 8 Obohacení: PAGE FlashPAGE Fractionator (Ambion) f01551 f01193 f01325 f01180 15min 20hours 9 Stabilita microRNA : Stabilita po izolaci Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Mraz et al., 2009 RNA cDNA Bravo et al., 2007 10 Stabilita microRNA : Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) Jung et al., 2010 11 Expression microarrays pro microRNAs: ovelmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond omalé zastoupení ve vzorku – separace microRNA ov lidském genovu cca 2000 genů – menší počet sond na čipu oněkteré mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt opre-miR, pri-miR, mature-miR omálo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků ozatím málo zkušeností a standardizace 1. 2. 3. Li and Ruan, 2009 12 3/ Labeling – značení: qNení možný labeling pomocí značených polyT při reverzní transkripci qPřímé značení (direct labeling) – většinou nějaká fluorescenční barva qNepřímé značení (indirect labeling) – probíhá nějaká reverzní transkripce/PCR Přímé značení: Jednoduché, rychlé a „čím méně kroků tím méně vnesených chyb a variability“ 1/ Značení guaninu v microRNA Flurochromem vážícím se na guanin jsou označeny miRNA (Ulysis Alexa Flour 546/647) Všechny lidské miRNA obsahují guanin, ale v různém množství Nemožnost usuzovat na vzájemnou expresi různých miRNA (různý obsah guaninu) (Babak et al., 2004) 2/ Značení pomocí Poly (A) polymerázy Můžu se rozhodnout jak dlouhý bude poly(A) a tím ovlivnit sílu signálu (Shingara et al., 2005) 13 3/ značení chemickou metodou 3‘OH skupina je oxidována na dialdehyd Následuje reakce s Biotin-X-hydraxidem –> Biotinilovaná miRNA Vazba fluoresceční molekuly-quantum dot (Liang et al., 2005) 4/ značení pomocí T4 ligasy Krátký značený oligonukleotid je připojen T4 ligásou k 3‘konci Výhodou je přednostní vazba na RNA o velikosti 18-30bp ->total RNA (Thomson et al., 2004; Castoldi et al., 2007) 14 Nepřímé značení: Značen je produkt reverzní transkripce či PCR Výhody: cDNA je pak stabilní a lze uchovat, Pre-amplifikace a tím snadnější detekce méně exprimovaných miRNA 1/ značení revezního transkriptu miRNA Reverzní transkripce pomocí náhodných 8-merů značených 2 biotiny (3‘-(N)8 – (A)12-biotin-(A)12-biotin-5‘ (Liu et al., 2004) Reverzní transkripce pomocí náhodných neznačených 7-merů, následně označeny s pomocí terminální transferázy a biotin-dideoxy-UTP (Sun et al., 2004) Nebezpečí chyb z nespecifické vazby primeru 2/ značení produktu RT-PCR Výhoda: snadná pre-amplifikace Dva adaptory fluorescenčně-značený primer (k adaptoru) (Miska et al., 2004) Nevýhoda: antisense strand přiromen při hybridizaci Rešením je různá délka sense a antisense ->PAGE (Baskerville, 2005) 3/ značení in vitro transkriptu Jeden z adaptorů je promotor T7 RNA polymerázy (Barad et al. 2004) 15 3/ Microarrays/ Próby: Problémy: krátké RNA, malé rozdíly v sekvenci, Tm 16 mosseb ppt horizontal modra Tm – melting temperature určité próby T – hybridizační teplota TmT ..........vyšší efektivita vazby miRNA qJe třeba navrhnout próby tak,aby měly všechny podobnou Tm qTo se u „dlouhých“ mRNA řeší vhodným výběrem oblasti genu k němuž bude sonda komplementární nebo délkou sondy q navíc některé miRNA jsou téměr sekvenčně totožné 17 Baskerville and Bartel, 2005 ÚPRAVA DÉLKY Li and Ruan, 2009 ÚPRAVA SÍLY VAZBY NUKLEOTIDŮ LNA próby (Locked Nucleic Acid) ribózový kruh je „uzamčen“ methylenovým můstkem mezi atomy 2´-O a 4´-C Použití LNA pro některé báze v próbě 18 SÍLA VAZBY: LNA vs DNA próba Tm až 720C (Castoldi et al., 2006) 19 SPECIFITA VAZBY: LNA vs DNA próba (Castoldi et al., 2006) 20 miRCURY LNA Array, Exiqon : 3 dny 21 Co se nemusí podařit: Nekvalitní RNA Nepodaří se značení Nepodaří se hybridizace Nepodaří se promývání Technická variabilita čipů je větší než ta biologická Nepodaří se validace dat pomocí RT-PCR, atd CIT_course_Oct2005_Lisa_Page_016 Práce s miRNA čipy je velmi obtížná. Všeobecně nižší míra standardizace. Obtížná interpretace získaných dat z pohledu biologického smyslu např. deregulace několika miRNA (nádor vs. zdravá tkáň apod.) 22 Chen, C. et al. Nucl. Acids Res. 2005 33:e179; doi:10.1093/nar/gni178 TaqMan-based real-time PCR quantification of mature miRNAs 23 3’ RNA adapter ligation 5’ RNA adapter ligation RT-PCR amplification Purify small RNA library Cluster generation and sequencing (Cluster Station and Genome Analyzer ) 125 bp 75 bp adaptors http://www.biomics.nl/images/illuminagenomeanalyzer.jpg Konstrukce cDNA knihovny malých RNA Cloning nebo deep sequencing Validace pomocí Northern blot Cheng et al., 2007 24 courtesy of G. Calin microRNA DNA mRNA PROTEIN 25 courtesy of F. Slack 26 27 microRNA exprese je schopná rozlišit původ nádoru Lu et al. Nature 435: 834, 2005 28 29 30 courtesy of S. Hammond 31 32 miR-17-92 is regulated by E2F transcription factors 33 Expression of miR17-19b Results in B-cell Lymphoma He, et al Nature 435(7043):828-33 2005 34 35 MICRORNAS EXPRESSION IN THE REGULATION OF P21 IN HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS Dasa Dolezalova Marek Mraz 36 MicroRNAs expression in the regulation of p21 in human embryonic stem cells 37 MicroRNAs expression in the regulation of p21 in human embryonic stem cells 38 Differences in microRNA expression in hESC vs NPCs 39 Induction of microRNAs after DNA damage in hESCs 40 MicroRNA pathway regulates p21 41 MicroRNA pathway regulates p21: miR-302s contribute 42 Conclusion 43 miR-15-16 are deleted in 60% of CLL cases (Calin et al., 2002) Chronic lymphocytic leukemia (CLL) qPrototype disease qMost frequent leukemia in adults qExtremely variable survival (months vs. dozens of years) qNo unifying genetic abberations (most frequently del 13q14) Mutated IgVH Unmutated IgVH Deletion/mutation p53 Trbusek et al., JCO, 2011 Mutated IgVH Unmutated IgVH Deletion/ mutation p53 miR-34a Mraz et al., Leukemia 2009 Mraz et al., Leukemia and Lymphoma, 2009 (i) microRNAs and DNA-damage response in CLL Picture1.png 45 q miR-34a is transcriptionally activated by p53 protein (He et al., 2007) q miR-34a is abnormally expressed in leukemia patients Mraz et al., Leukemia 2009 Mraz et al., Leuk Lymphoma, 2009 Asslaber et al., Blood, 2010 (i) microRNAs and DNA-damage response in CLL He et al., 2007 46 miR-34a clinical assay University of California, Mayo Clinic, University of Salzburg, European Research Initiative on CLL P=0.03 r2 = 0.995 LAB RESEARCH DIAGNOSTIC TEST CLINICAL TRIALS n=200 47 DNA damage response Picture4.tif qIn vivo samples from ~100 leukemia treated patients q qlarge scale search for miRNAs that are activated after chemo-immuno therapy in vivo q qApplication of miRNAs as predictive and prognostic markers 48 • •Definování expresního profilu miRNA u pacientů s CLL a delecí/mutací p53 genu. o obr LL2 Mraz et al., Leukemia 2009 Mraz et al., Leukemia&Lymphoma, 2009 Mraz et al., BBRC, 2009 Mraz et al., 2012 Mraz et al., 2013 Tab. 1 Exprese microRNA u pacientů s nepříznivýni prognostikými markery (nemutované IgVH a delece/mutace p53) (dle 1 Calin, 2005; 2 Mraz, 2009b) MicroRNA Chromozomální oblast Exprese miRNA u CLL vzorků s: nemutovaným IgVH (ZAP70+) vs. mutovaným IgVH (ZAP70-) delecí/mutací p53 (bez ohledu na IgVH) vs. wild-type p53 (bez ohledu na IgVH) miR-15a 13q14 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-16-1 13q14 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-16-2 3q26 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-23b 9q22 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-24-1 9q22 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29a-2 7q32 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29b-2 1q32 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-29c 1q32 NÍZKÁ1 NÍZKÁ2 miR-146 5q34 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-155 21q21 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-195 17p13 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-221 Xp11.3 VYSOKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-223 Xq12 NÍZKÁ1 NEZMĚNĚNA2 miR-34a 1p36 NEZMĚNĚNA2 NÍZKÁ2 miR-17-5p 13q31 NEZMĚNĚNA2 NÍZKÁ2 miR-142 NÍZKÁ2 NEZMĚNĚNA2 Je to k něčemu dobré i v medicíně? 49 • •potentially usefull as therapeutic targets 50 Calin et al., 2008 51 Děkuji za pozornost Marek Mráz marek.mraz@email.cz LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Lékařská fakulta MU FN Brno_modra_ctverec mosseb ppt horizontal modra 52 MicroRNA-650 Expression Is Influenced by Immunoglobulin Gene Rearrangement and Affects the Biology of Chronic Lymphocytic Leukemia Marek Mraz1,2, Dasa Dolezalova3, Karla Plevova1,2, Katerina Stano Kozubik1,2, Veronika Mayerova1,2, Katerina Cerna1,2, Katerina Musilova1,2, Boris Tichy1,2, Sarka Pavlova1,2, Marek Borsky2, Jan Verner1,2, Michael Doubek1,2, Yvona Brychtova2, Martin Trbusek1,2, Ales Hampl3, Jiri Mayer1,2, Sarka Pospisilova1,2 Blood, epub ahead of print 53 IgL locus structure Das et al., 2009 miR-650 identified by miRAGE clonig approche in colorectal cells (Cummins et al., 2006) miR-650 is expressed in: q breast cancer cells (Chien et al., 2011) q gastric cancer cells (Zhang et al., 2011) q colon cancer cells (Cummins et al., 2006) q melanoma cells (Chan et al., 2011) 54 qAssociated with IgG production and V(D)J recombination (Koralov, 2008;Vigorito, 2007) q q • • MicroRNAs regulate production of imunoglobulins Lindsay, 2008 55 High expression of miR-650 in cells utilizing: V2-8, V2-14, V2-5, V2-18, V2-23 subgenes for IgL Copy of Copy of po pripominkych.jpg Mraz et al., Blood, 2012 56 Lambda locus rearrangement utilizing V2 family is coupled with activation of miR-650 expression Copy of Copy of po pripominkych.jpg 57 Mraz et al., Blood, 2012 Expression miR-650 is associated with CLL prognosis higher expression is favorable Copy of Copy of po pripominkych.jpg 58 Mraz et al., Blood, 2012 miR-650 reduces the proliferative capacity of B-cell proliferation Copy of Copy of po pripominkych.jpg miR-650 inhibits cell cycle progression by regulating p16INK4-mediated pathway (Chien et al., 2011) 59 Mraz et al., Blood, 2012 miR-650 regulates CDK1, ING4 and EBF3 in B-cells Copy of Copy of po pripominkych.jpg q~50% of predicted targets of miR-650 are expressed in B-cells with numerous being important in B-cells physiology (Gene Ontology and Functional analysis by DAVID tool). q qmiR-650 regulates the Cyclin Dependent Kinase 1 (CDK1) in breast cancer cells (Chien etal., 2011) qInhibitor of Growth 4 (ING4) in gastric cancer cells (Zhang et al., 2011) qThe EBF3 protein is a putative target with the highest score (TargetScan) 60 Mraz et al., Blood, 2012 miR-650 qV2 family of subgenes for lambda IgL includes homologues of miR-650 qcoupled activation of miR-650 expression with IgL expression qmiR-650 is associated with CLL prognosis qmiR-650 regulates proliferation of B-cells qtargets for miR-650: CDK1 (Cyclin Dependent Kinase 1) ING4 (Inhibitor of Growth 4) EBF3 (early B cell factor) DISCRIPTION OF A UNIQUE MECHANISM OF MICRORNA EXPRESSION COUPLED WITH IMMUNOGLUBULIN EXPRESSION Conclusion (I) 61