LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapie
Moderní metody analýzy genomu
Masivně paralelní sekvenování I
20.3. 2013
Boris Tichý
Sekven(c)ování
Gel → kapilární elektroforéza
Dideoxy-NTPs → ukončení polymerace
Značené primery nebo ddNTPs
Sekven(c)ování
Analyzuje směs DNA fragmentů
Heterozygotní mutace (1:1) →
Směs fragmentů
(např. nespecifická PCR amplifikace)
Jednotlivé fragmenty (jednotlivé alely z jednotlivých buněk)
→ klonování a sekvenování
Masivně paralelní sekvenování
PCR amplifikace jednotlivých DNA fragmentů a sekvenování
nebo
Sekvenování jednotlivých DNA fragmentů
= Single molecule sequencing
Technologie a přístroje přizpůsobeny paralelizaci
Stovky milionů jednotlivých PCR reakcí a sekvenací najednou
(běžně prodávané kapilární sekvenátory jsou max. 96-kapilární)
Většinou kratší sekvence – desítky bazí
(kapilární – běžně až 1000 bazí)
Masivně paralelní sekvenování – klonální amplifikace
Paralelizace a miniaturizace PCR (nebo podobné metody)
Emulzní PCR
Bridge amplifikace
Rolling circle amplifikace
Droplet PCR
Snaha o sjednocení PCR podmínek
Primery shodné pro všechny sekvence (ligace adaptorů)
! GC-rich oblasti vždy obtížné
Masivně paralelní sekvenování
Sequencing by synthesis
Polymeráza
Sestavování nového řetězce z jednotlivých nukleotidů
Sequencing by ligation
Ligáza
Sestavování nového řetězce z oligonukleotidů
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Roche/454
První na trhu
Emulzní PCR + pyrosekvenování
Picotiter plate
Sekvenační reakce ve vlastních
(mikro)jamkách
Dlouhé fragmenty, malá kapacita
Chemie
Nemodifikované nukleotidy
Jeden typ nukleotidu/cyklus
Masivně paralelní sekvenování Technologie Roche/454
Emulzní PCR
Masivně paralelní sekvenování Technologie Roche/454
Pyrosekvenování
Masivně paralelní sekvenování Technologie Roche/454
Výhody
Dlouhé sekvence
Diagnostika - Roche
Nevýhody
Chybovost - homopolymerní úseky
Cena/kapacita
Pracnost
Standardizace
Malá kapacita – analýzy exprese RNA obtížné
Dostupné přístroje
Genome Sequencer FLX
GS Junior
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Ion Torrent, Ion Proton
Emulzní PCR
Monitorování H+
uvolněných při inkorporaci nukleotidu
Speciální čipy
Sekvenační reakce ve vlastních (mikro)jamkách, dno tvoří polovodičová
elektroda citlivá na pH
Zatím kratší fragmenty (200+), rychlé
Nízká cena, kapacita 10Mb - 100Gb
Chemie
Nemodifikované nukleotidy
Jeden typ nukleotidu/cyklus
Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Torrent
http://www.youtube.com/watch?v=nFfgWGFe0aA
http://www.youtube.com/watch?v=yVf2295JqUg
http://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc