LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Moderní metody analýzy genomu Masivně paralelní sekvenování II 24.3. 2011 Boris Tichý Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina (Solexa) Nejrozšířenější “Bridge” amplifikace + sekvenování s reverzibilními terminátory Flow cell Sekvenační reakce ve shlucích (clusters) náhodně na ploše Kratší fragmenty, velmi vysoká kapacita Chemie Fluorescenčně značené (4 barvy) reverzibilně terminační nukleotidy Všechny čtyři nukleotidy/cyklus Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Two PCR primers are attached to the surface of flowcell. One of the primers has a cleavable site (cross on red primer); Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Preamplified library is denaturated in NaOH, then hybridization buffer is added to shift pH to neutral value. Library is loaded into the channel in neutral aquatious solution. DNA molecules can hybridize to the PCR primers. Red primer hybridize with a library molecule on the picture(complementary strand of this molecule have a chance to form a hybrid with a green primer). Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Elongation reaction: extension mix (buffer, dNTP's, Taq polymerase) is pumped into a channel. Hybridized primer extended on library molecule. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Formamide Original library molecule is denatured and washed away. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Extension buffer Extended molecule bends and hybridizes to a second PCR primer (forms a bridge). Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Extension mixture Extension of hybridized primer. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Formamide washing Two DNA strands are denatured. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Extension buffer Extended molecules may hybridize to each other again or find other PCR primers. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Extension buffer Extended molecules may hybridize to each other again or find other PCR primers. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Extension mixture In the second case they will duplicate again. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Formamide washing DNA strands are denatured. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace After 35 cycles cluster consists on a number of double-stranded bridges. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace DNA is denaturated. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace One primer is cut off and washed out. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace the last operations, which are done on Cluster station are: * * blocking of all 3' ends (ddNTP's and terminal transferase) to prevent extension of DNA molecules on each other; * annealing of sequencing primer. Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Bridge amplifikace Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Sekvenování s reverzibilními terminátory Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Sekvenování s reverzibilními terminátory Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Sekvenování s reverzibilními terminátory Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Sekvenování s reverzibilními terminátory Masivně paralelní sekvenování Technologie Illumina Sekvenování s reverzibilními terminátory Masivně paralelní sekvenování Technologie Roche/454 Výhody Dlouhé sekvence Diagnostika - Roche Nevýhody Chybovost - homopolymerní úseky Cena/kapacita Pracnost Standardizace Malá kapacita – analýzy exprese RNA obtížné Dostupné přístroje Genome Sequencer FLX GS Junior Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Torrent Emulzní PCR Monitorování H+ uvolněných při inkorporaci nukleotidu Speciální čipy Sekvenační reakce ve vlastních (mikro)jamkách, dno tvoří polovodičová elektroda citlivá na pH Malá kapacita, zatím kratší fragmenty (100+) Nízká cena Chemie Nemodifikované nukleotidy Jeden typ nukleotidu/cyklus Masivně paralelní sekvenování Technologie Ion Torrent