LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY
Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno
Centrum molekulární biologie a genové terapie
Moderní metody analýzy genomu
Další nové technologie
9.12. 2011
Boris Tichý
Kvantitativní (real-time) PCR
Standard: jednotlivé zkumavky, kapiláry nebo destičky (96,384,1536 jamek)
Nově:
Mikrofluidní technologie a qPCR “čipy”
Více vzorků/genů
Nižší spotřeba vzorků/chemikálií
Méně pracné
TaqMan Array (Life Technologies)
Mikrofluidní náhrada 384-jamkové destičky
Primery + sondy už od výroby
Malé reakční objemy (1 uL)
Minimum pipetování
Různé konfigurace – 1-8 vzorků, 11-380 genů
OpenArray (Life Technologies)
Array reakčních mikroreakčních jamek (“holes”)
Primery (+ sondy) už od výroby
Velmi malé reakční objemy (33 nL)
3072 jamek – 12-144 vzorků, 18-224 genů
BioMark (Fluidigm)
Mikrofluidní technologie – umožňuje rozvod primerů i vzorků
Různé konfigurace – 48-192 vzorků, 24-96 genů
Dynamic array
Běžná qPCR kvantifikace podle intenzity fluorescence
Genotyping, exprese
Digital array
Naředění vzorku tak, aby v jamce bylo 0-1 kopií cíle
PCR – 770 reakcí pro každý gen a vzorek (48 vzorků)
Digitální PCR – počítání pozitivních a negativních jamek
Access array
Target amplification for Next-gen sequencing
http://www.fluidigm.com/biomark-system.html
xMAP a xTAG (Luminex)
Fluorescenčně značené kuličky (microspheres) – až 500 “odstínů”
Různé navázané molekuly → různé typy analýz
Protilátky, antigeny, receptory → proteiny, hormony
Oligonukleotidy → exprese
Oligonukleotidy → xTAG (primer extension metoda) → genotyping
Detekce průtokovou cytometrií (nově i mikroskopie)
Běžně měřeny desítky kuliček/analyt/vzorek → robustní
Otevřená technologie – mnoho dodavatelů
Nejběžnější: Cytokiny, patogeny, genotyping, miRNA
http://www.luminexcorp.com/TechnologiesScience/xMAPTechnology/index.htm
Veracode (Illumina)
Holograficky značené skleněné válečky (240 x 28 uM)
Různé navázané molekuly → různé typy analýz
Až 384 analytů
http://www.illumina.com/media/flash_player.ilmn?
dirname=systems&swfname=aboutVeraCode&width=650&height=410&iframe
nCounter (Nanostring)
Hybridizace se single-molecule detekcí
Molecular barcodes → fluorescenční značky
Digitální exprese → přímé počítání molekul
Až 800 genů současně
Genová exprese, miRNA , CNV analýza
http://www.nanostring.com/products/subpage.asp?id=360
MassArray (Sequenom)
Hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF) DNA
Aplikace
Genotypizace (SNP)
Metylace
Genová exprese
Typizace mikroorganismů
Somatické mutace
Multiplexování (až 36 cílů/vzorek)