Histologie - cvičení teacher2 Laboratorní zpracování tkání a orgánů pro světelnou a elektronovou mikroskopii HISTOLOGIE n nNauka o stavbě normálních, tj. zdravých buněk, tkání a organů na mikroskopické a submikro-skopické úrovni n - obecná histologie + cytologie n - speciální histologie = mikroskopická anatomie (stavba orgánů jednotlivých systémů) n nvýznam histol. Vyšetření v klinické praxi: onkologie, chirurgie, hematologie, patologie a soudní lékařství n Zpracování tkání a orgánů pro účely histologického vyšetření ve světelném mikroskopu (příprava trvalého histologického preparátu) nODBĚR vzorků nFIXACE tkání nPRANÍ nZALÉVÁNÍ (parafinové bločky) nKRÁJENÍ nNAPÍNÁNÍ A LEPENÍ řezů nBARVENÍ řezů nMONTOVÁNÍ c trvalé preparáty ODBĚR MATERIÁLU n nvelikost odebraného vzorku tkáně 5 – 10 mm3, fixace následuje bezprostředně! n nbiopsie z živého organizmu (v průběhu chirurgických zákroků; neinvazivní odběr – stěr z povrchu sliznice) n - excise (vyříznutí) n - punkce dutou jehlou (jaterní nebo ledvinný parenchym, kostní dřeň) n - kyretáž (např. endometrium) n nnekropsie z mrtvého organizmu (pitva); laboratorní zvíře n specialne-ihly07 Pomůcky k odběru: kyreta uterine%20curette Medin Medin Medin trokar – dutá jehla s mandrenem specialne-ihly01 FIXACE nCílem fixace je zachování struktury buněk a tkání ve stavu, který je co nejpodobnější tomu, v němž se vyskytují zaživa - „šetrné“ usmrcení buňky s minimem artefaktů n nFixace předchází vysoušení, svraštění a autolýze tkáně. Zastaví metabolické děje jejich zpomalením (v případě zmrazení) či inaktivací enzymů a dalších proteinů (denaturace = změna konformace) n nPožadavky na fixační činidlo nzachovat strukturu nrychle prostoupit tkáň nneovlivňovat výsledek barvení n Během fixace se prakticky nelze vyhnout vzniku artefaktů. Když chemické fixativum proniká do hloubky tkáně (zejména to platí pro dehydratující fixativa, jakými jsou alkohol, aceton aj.), představuje jeho čelní hranice výrazný fyzikálně-chemický gradient, který může změnit distribuci některých typů molekul v tkáni a kupříkladu je natlačit na biomembrány (o něž se tyto látky zastaví). V případě vysoce difuzibilních rozpustných látek s malými molekulami (ionty, nízkomolekulární jednoduché sacharidy, některé organické kyseliny, urea) nedochází během klasického způsobu chemické fixace k jejich imobilizaci a během interakce s roztokem fixativa je původní distribuce těchto látek v tkáni zcela setřena. n fyzikální -vysokou teplotou (var, žíhání nad plamenem) - nízkou teplotou (lyofilizace, mrazová substituce - kryoprezervační látky) n nchemická - roztoky organických a anorganických látek -imerze – ponoření do fixativa -perfuze – promývání (intravenózní aplikace fixativa) n FIXACE metoda freezing-drying (vysoušení za mrazu) − rychlá sublimace vody, která nastává ve vakuu; velmi drahá metoda; metoda velmi rychlého zmrazení − pomocí tzv. suchého ledu nebo kapalných plynů např. dusíku; rychlost je důležitá, aby nevznikly krystaly ledu, které poničí buňky. nátěr krve nebo bakterií na podložním skle se protáhne plamenem kahanu, mikrovlnné záření − řízený ohřev v mikrovlnné troubě v rozmezí 45 − 55 °C [1] jemně denaturuje bílkoviny vzorku (použití v běžných histopatologických metodách, ale i pro rychlé zpracování peroperační biopsie). nOrganická – Aldehydy – formaldehyd (SM) n glutaraldehyd (EM) n – Alkoholy – etanol 96 – 100 % (absolutní etanol) n – methanol, aceton n – Organické kyseliny – led. octová, pikrová, trichloroctová n nAnorganická – Anorganické kys. – chromová, n – Soli těžkých kovů – HgCl2, oxid osmičelý (OsO4) n n nSměsi: FLEMMING (OsO4), ZENKER, HELLY, SUSA (HgCl2), n BOUIN (kys. pikrová), CARNOY (alkohol) n n nPostup fixace – vzorek přelít 20 – 50 násobným množstvím fixačního činidla (1 cm3 : 20 – 50 ml), 12 – 24 hodin při pokojové teplotě Chemická fixativa Aldehydy při fixaci rychle reagují s aminoskupinami aminokyselin (vyčnívajících mimo peptidický skelet) a dalších sloučenin a za určitých podmínek ponechají zachovanou alespoň část enzymatické a imunoglobulinové aktivity, což umožňuje použít IHC metody na lokalizaci příslušných aktivit ve tkáních. Mění se struktura cytosolu a vzniká z něho gel, např. tvorbou příčných methylenových můstků, které mohou vázat rozpustné proteiny k nerozpustným proteinům cytoskleletu. K dalším činidlům chemické fixace patří vedle aldehydů i alkoholy (ethanol či methanol, jež odnímají z tkáně vodu), kyseliny (octová, trichloroctová, pikrová), event. soli těžkých kovů. Tekutiny musíme dát 25−50 krát více než je objem vzorku PRANÍ a ZALÉVÁNÍ nodstranění fixačního činidla ze vzorku; výběr vypíracího roztoku závisí na fixaci: voda nebo alkohol (70-80%) n nProsycení, zalévání – příprava vzorků pro krájení (tvrzení) n Zalévací média – prosycují (prostupují) vzorek a tvrdnou n - ve vodě rozpustná: želatina, celodal (polymer močoviny a formolu) n - ve vodě nerozpustná: parafin, paraplast n (vzorky se musí odvodnit – vzestupná alkoholová řada) Zalévání do parafinu nOdvodnění – odvodnění fixovaných vzorků vzestupnou řadou etanolu (50%, 70%, 90%, 96% každá lázeň 2 – 6 hodin) n nProjasnění – vytěsnění alkoholu mediem, které se mísí s parafinem – benzen nebo xylen n nProsycení – rozpuštěným parafínem (bod tání 56°C) n nZalití – plastové, papírové nebo kovové komůrky n - komůrky jsou rychle ochlazeny ponořením do studené vody formy2 formy KRÁJENÍ nMikrotomy – světelný mikroskop - tloušťka řezů 1 – 10 μm nUltramikrotomy – elektronová mikroskopie – 100 nm groot_acc_11 rotary Sáňkový mikrotom – blok je upevněný v držáku, nůž se pohybuje horizontálně Rotační mikrotom – nůž je fixní, držák s bločkem se pohybuje vertikálně ESM-150S microtome - Alternativa k zalévání – nativní i fixovaný vzorek - Kryostat – zmrazení na -20 a méně ºC - Kryotom – mrazicí rotační mikrotom (0-60 ºC) ZAMRAŽENÍ krotom krotom2 kryotom3 NAPÍNÁNÍ ŘEZŮ nNapínání: na hladině teplé vody (45ºC) se řezy narovnají a vypnou nLepení: z vody jsou řezy přeneseny na podložní skla s adhezivním filmem (želatina nebo směs glycerin-bílek) a uloženy do termostatu (37º C). HIST005 Před barvením se z řezu na skle musí odstranit zalévací medium, které by bránilo průniku barviv. Např. parafin – deparafinace rozpustidlem parafinu, obvykle xylénem. BARVENÍ nPro zviditelnění struktur v řezu – buňka a její součásti vykazují různou afinitu k barvivům: n nchromofilní (chromatofilní) x chromofobní n nNejčastěji barvení na základě pH struktury n nzásaditá (bazická) barviva („jaderná“) – reagují s kyselými strukturami buňky a tkání (NK v jádře aj.) n bazofilie – bazofilní struktury n nkyselá barviva („cytoplazmatická“) – reakce se zásaditými strukturami n acidofilie – acidofilní struktury v buňce n n polychromatofilní (heterofilní) – afinita k oběma druhům barviv nORTOCHROMAZIE- bunečné struktury se barví stejnou barvou, jakou má barvivo (HE) n nMETACHROMAZIE- bunečné struktury se barví jinou barvou, jakou má barvivo n nPř. toluidinovou modří se v žírných buňkách barví jádra modře (ortochromaticky) a granula červenofialově (metachromaticky) TYPY BARVENÍ nrutinní, přehledná – HE, AZAN - demonstrují všechny základní složky n nspeciální – vizualizace vybraných struktur, cytologické nMassonovy trichromy: žlutý - HEŠ, modrý - AZAN, zelený trichrom (kolag.vlákna) norcein, aldehydový fuchsin (elast.vlákna) aj. nImunohisto- a imunocytochemické metody n nimpregnační – AgNO3 (nervová nebo retikulární vlákna) HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) nHematoxylin – zasaditý nEosin – kyselý n nPostup: nOdstranění parafinu xylenem nRehydratace sestupnou řadou alkoholů (100% Ò96% Ò80%) nBarvení hematoxylinem ð jádra - modro-fialová nDiferenciace kys. alkoholem a vodou (odstranění přebytku barviva) nBarvení eosinem ð růžová - cytoplazma, vazivo, svaly nPraní ve vodě (odstranění přebytku barviva) nDehydratace „vzestupnou“ řadou alkoholů (80% Ò96%) nProjasnění v xylenu vertical staining jar http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif http://www.aname.es/microscopia/ems/histology/HIST44.gif xylen I xylen II 100% 96% H2O hematoxylin kyselý etanol etanol etanol xylen IV xylen III 100% 96% H2O eosin H2O etanol etanol HEMATOXYLIN – EOSIN (HE) deparafinace zavodnění praní barvení diferenciace projasnění odvodnění praní barvení praní Hematoxylin a eosin (HE) N_UR_KD_09 cytoplazma jádra kolagenní vazivo mhe_staining tray_of_mhe_oyster_slides vertical staining jar http://www.bio-optica.it/gfx/set%203.jpg nosič skel (košíček) Pomůcky pro barvení 5089_male_biology_scientist_using_microscope Autotechnikon,barvící automat (automat pro barvení) SHANDON LIPSHAW VARISTIAN 24-4 vertical staining jar řada boxů (kyvet) s barvicími medii nLeica ST 4040 Lineární barvící automat - velkokapacitní barvení vzorků jedním programem (např. H&E až 1000 skel). Modulární systém. Během barvícího procesu je uživatel chráněn aktivním odsáváním skrz uhlíkový filtr (lze napojit na centrální odtah v laboratoři ). lineární barvící automat Leica barveni 1 Cutting a slice of mussel Tweezers drop a piece of mussel into a dehydration cassette Several yellow dehydration cassettes lying in a beaker containing (clear) ethanol Microtome shaving a slice off a wax block A metal basin filled with warm water Slipping a slide under wax floating in a water bath 1 2 3 4 5 7 8 1 – odběr 2, 3 – fixace 4 – zalévání 5 – krájení 6,7– napínání řezů 8 - barvení autotechnikon Leica 4 6 MONTOVÁNÍ nuzavření preparátu – kapkou montovacího media a krycím sklíčkem Þ trvalý preparát n n n n n n n n nMontovací media: nrozpustná v xylenu – kanadský balzám nrozpustná ve vodě – glycerin-želatina, arabská guma http://www.canemco.com/images5/4470.jpg http://nationaldiagnostics.com/images/h1_7a.gif 275496597_bc08febb4b FarSideMicroscope Výsledky barvení: nHE = Hematoxylin – Eosin n jádra – modro-fialová n cytoplazma a kolagenní vlákna – růžová n svalová tkáň – červená n n nHEŠ = Hematoxylin – Eosin – Šafrán n kolagenní vlákna – žlutá n n nAZAN = AZokarmín – Anilinová modř – oranž G n jádra – červená n erytrocyty – oranžové n svalová tkáň – červená n kolagenní vlákna – modrá Hematoxylin a eosin (HE) uri04 basofilní x acidofilní cytoplazma HP_img6-14-26ventr fundus ventriculi Hematoxylin, eosin a šafrán (HEŠ) 109 Azokarmín a anilin. modř (AZAN) aza_005 kolagenní vlákna modrá ledvina MASSON%201 kolagenní vlákna zelená Zelený trichrom Cytologická barvení – podle Heidenhaina n n 22 suppl kosterní svalová tkáň železitý hematoxylin Cytologická barvení – podle Heidenhaina 101 mitochondrie v hepatocytech Impregnace „stříbrem“ n n 6 slezina – retikulární vlákna 197%20cortex cerebellum – nervová vlákna Barvicí metody: přehledné – AZAN, HE demonstrují všechny složky tkání speciální zdůrazňují určité buněčné nebo tkáňové složky impregnační soli Ag, Au nebo Os N_UR_KD_06 Masson-Trichrome-g HistologySlidesOriginal004 DSCN0909 glykogen v hepatocytu Zpracování tvrdých tkání (zub, kost) ndekalcifikace (odvápňování) – převedení nerozpustných vápenatých solí do roztoku pomocí kys. mravenčí nebo chelatonu (EDTA), časově náročné – dny až týdny n nvýbrusy – tenké ploténky (50 – 70 μm) zhotovené postupným zbrušováním materiálu (brusky, matné sklo, pasty, prášky) – nelze barvit SKLOVINA DENTIN Výbrus zubu Kapka krve rozetřená do tenké vrstvy na podložním skle -dvě směsi barviv - podle May-Grünwalda (eozinát azuru II. rozpuštěný v metanolu) a Giemsy-Romanowskeho (eozinát metylenové modři a eozinát metylenazuru rozpuštěný ve směsi stejných dílů metanolu a glycerolu). - Imerze - nahrazení vzduchové mezery mezi čelní čočkou objektivu mikroskopu a preparátem vrstvou imerzní tekutiny – index lomu>1 = NA Zpracování krve – krevní nátěr krevní nátěr Krev Numercká apertura je maximální úhel, pod kterým ještě může světelný paprsek vstoupit do světlovodu. Histochemické metody nlokalizace chemických látek v buňce n n - průkaz proteinů (detekce –NH2 nebo –COOH konce) n - DNA, RNA (reakce pentóz) – Feulgenova metoda (DNA~) n - metylová zeleň a pyronin (DNA~ i RNA~) n - sacharidů – PAS reakce (oxidace –OH na aldehyd) ~ n - lipidů – např. lyzochromy (barviva rozpustná v tucích) n - pigmentů – přímo n - anorg. látek (Fe, Ca, Zn) – postupy analytické chemie n n PAS = Periodic Acid Schiff s reagent Imunocyto- a imunohistochemie ndetekce pomocí vazby značené protilátky Ag-Ab komplexy (přímý důkaz) nebo Ag-Ab-Ab (sekundární nepřímý důkaz) Značení: - fluorochromy – rodamin, texaská červeň - enzymy – křenová peroxidáza, AF, acetylcholinesteráza - radioizotopy (jódu) imuno coverslip plate GFAP imuno Detekce GFAP - astrocyty coverslip coverslip2 coverslip3 Imunocytochemická metoda ab Elektronová mikroskopie Elektronový mikroskop - Obraz je tvořen elektronovým paprskem ve vakuu - čočky – elektromagnety - projekce na fluorescenční stínítko Transmisní (prozařovací) el. mikroskop - TEM - Snímán průchod elektronového paprsku, rozlišení 0,2-0,3 nm (reálně 5 nm) Rastrovací (řádkovací, scan) el. mikroskop – SEM - Snímán odraz elektronového paprsku, rozlišení 10-20 nm Zpracování tkání pro elektronovou mikroskopii (EM) nPožadavky na pracovní podmínky: npH všech roztoků (medií) 7,2 – 7,4. (pufry – kakodylátový nebo fosfátový) nbezprašnost nroztoky (media) – šetrné působení na tkáně (! – minimum artefaktů) POSTUP nODBĚR – okamžitá fixace, velikost tkáňového bločku do 1 mm3 n nFIXACE – glutaraldehyd (vazba aminoskupin) + OsO4 (vazba lipidů) – dvojitá fixace n nPRANÍ – kakodylátový pufr n nDEHYDRATACE – alkohol, aceton n nZALÉVÁNÍ – vzorky se vkládají do želatinových kapslí nebo forem z plastu vyplněných zalévacím mediem. Používají se epoxidové pryskyřice (Epon, Durcupan, LR White, LR Gold, Araldite) – ve vodě nerozpustná media http://www.erawat.com/gifs/tablets.jpg BEEM* Capsule Holders Capsules; Embedding, Size 00 Mold for Long Tissues Flat Embedding Molds http://stoopidsavant.com/v-web/gallery/albums/em/IMG_8449.sized.jpg Zalévací komůrky: želatinové (1), plastové (2) nosiče (držáky) kapslí (3) ploténky s komůrkami (4, 5) bločky připravené pro krájení 1 2 3 4,5 microtome Image5 Image6 http://www.udel.edu/Biology/Wags/b617/micro/micro21.gif Odstranění přebytku tvrdého zalévacího media a zhotovení pyramidy s minimální řeznou plochou (0.1 mm2). Minimum tkáně (černý shluk) ve vrcholu pyramidy Úprava pyramidy (trimování) KRÁJENÍ npo odstranění přebytku media (trimming) a vytvoření pyramidy se z malé plošky (0.1 mm2) krájí jednotlivé ultratenké řezy (70 – 100 nm) ultramikrotomy n npoužívají se skleněné nebo diamantové nože s vaničkou – řezy splývají na hladinu vody ve vaničce a odtud jsou přeneseny na síťky (Cu) 05-tem-ultramicrotome_zoom http://bomi.ou.edu/bmz5364/making-knives_files/image006.jpg https://www.shop.boeckelerdirect.com/images/product_17_lg.jpg Ultramikrotomové nože: skleněný diamantový ultratrim 06-tem-ultramicrotome-detail_zoom http://www.udel.edu/Biology/Wags/b617/micro/micro9.gif fig7 Molybdenum MO TEM grids Molybdenum MO TEM grids square transmission Molybdenum MO TEM grids oval transmission Image17 microtome_close_up1 MAN-01 Krájení, nosné síťky Síťka se třemi řezy typy sítěk KONTRASTOVÁNÍ nprincip odlišení struktur – různý rozptyl svazku elektronů v závislosti na denzitě struktur; „elektronová barviva“ – směsi těžkých kovů: uranylacetát nebo citrát olovnatý Na kapce barviva je položena nosná síťka tak, aby ultratenké řezy byly vystaveny působení barviva. 24245 Dscn1204 30374 šilhací oči Rozdíly mezi SM a EM SM EM Odběr < 1 cm3 minuty < 1 mm3 sekundy Fixace formaldehyd 12 – 24 hod. glutaraldehyd 1 – 3 hod. Zalévání parafin epoxid. pryskyřice (Durcupan) Krájení Tloušťka řezů mikrotom 5 – 10 mm ultramikrotom 50 – 100 nm Barvení (LM) Kontrastování (EM) barviva (hematoxylin – eosin) těžké kovy (uranylacetat, citrát Pb) Montování + --- Výsledek histologický preparát foto z fluoresc. stínítka - elektronogram řas epit SEM řas epit1 řas epit 2 SM SEM TEM Trachea – řasinkový epitel Co byste určitě měli znát: Fáze zpracování tkání a orgánů pro účely světelné mikroskopie -Odběr materiálu, fixace a fixační činidla -Zalévání a zalévací média -Mikrotomy – krájení, lepení parafinových řezů -Barvení parafinových řezů hematoxylinem a eozinem (co je zbarveno a jak) Postup při vyšetření v prozařovacím elektronovém mikroskopu