Regulace enzymů Tomáš Pruša Rev. 0.7 Inhibice • Látky snižující syntézu enzymu (transkripci E) • Nedostatek endogenních kofaktorů • Nedostatečná výživa • Interakce • Inhibitory enzymů Inhibice • Ireverzibilní • Reverzibilní • Kompetitivní • Nekompetitivní • Akompetitivní • Smíšené Inhibice • Ireverzibilní • Reverzibilní • Kompetitivní (KM se zvyšuje) • Nekompetitivní (KM se nemění, vmax se zmenší) • Akompetitivní (KM i vmax se zmenší) • Smíšené (mění se poměr KM a vmax) Inhibice • Specifické inhibitory • Více u CYP • Nespecifické inhibitory • Těžké kovy (vazba na thiolové skupiny) • CO • Aminobenzotriazol Inhibice CYP • Reverzibilní inhibice • Kompetitivní • Nekompetitivní (pomalá) • Ireverzibilní inhibice Inhibitory CYP • Reverzibilně vázané na hem • Oxid uhelnatý • Tvořící kvazi-ireverzibilní komplexy s hemovým Fe • Oktylamin • Ireverzibilně vázané na hem • 1-aminobenzotriazol - vazba na 2 dusíky pyrolového jádra, inhibuje cca 80 % aktivity CYP (2B1, 2C11, 3A*), neinhibuje 2A1 Komplexy CYP-metabolit inhibitoru • Vazba mimo aktivní místo = nekom. inhibice • Aktivace inhibitoru • Minimálně 1 průchod CYP • Benzodioxoly, hydraziny, isosafrol • Disociace = obnovení aktivity • Alkylaminy • Syntéza de novo MI komplexy • Benzodioxol a mtb • Inhibice 2B1 • Delší doba inhibice než reverzibilní inh. Autokatalytická inaktivace CYP • Meziprodukty schopné alkylovat CYP • Inaktivace funkce • Vazba na apoprotein (ne na hem) • Syntéza CYP de novo • Olefiny, cyklopropylaminy, chloramfenikol,… Specifické inhibitory CYP • Enzym odpovědný za mtb konkrétního léčiva • Málo studií sledující vztah struktura-aktivita • Chloramfenikol - acetylace lysinového zbytku v aktivním místě, P450 nemůže přijímat elektrony z NADPH cytochrom P450 reduktázy. Má vliv na 2B1, 2C6, 2C11, nemá vliv na 1A1 a 1A2. Specifické inhibitory CYP • Makrolidová ATB • Erytromycin • Tvorba MI komplexů • 3A u potkana, 3A4 u člověka • Naftoflavon • Reverzibilní kompetitivní inhibitor • CYP 1A a 1A2 Detekce forem CYP • Jak? Detekce forem CYP • Selektivní induktor a inhibitor • Specifické substráty • Imunoinhibice • Western Blotting • Exprese CYP cDNA (např. kvasinky) Indukce • In vivo • Po určité době po podání • Zvýšení syntézy CYP • Specifická • Substrát izoenzymu, který indukuje Indukce • Odpověď buňky na chemický stres • Indukovatelnost • Enzymů 1. fáze biotransformace • Enzymů 2. fáze biotransformace • Transportních systémů • Zásah do endogenního mtb a buněč. cyklu Induktory • Lipofilní sloučeniny • Dlouhý biologický poločas • Málo se metabolizují • Kumulace • Opakované podání (není podmínkou) Receptory • AhR (aryl hydrocarbon receptor) • PXR (pregnane X receptor) • CAR (constitutive androstan receptor) • PPAR (peroxisome proliferator activated rc) • GR (glucocorticoid rc) • VDR (vitamin D rc) Mechanismus • Indukce MC typu (PAH) → AhR • Indukce PB typu → CAR • Indukce steroidy → PXR, CAR • Indukce ethanolem • Indukce klofibrátem → PPAR AhR (PAH) • Historicky dobře prozkoumaná • Indukční odpověď silná • Interakce s Ah receptorem • Indukce • CYP 1A*, 1B* • UGT • GST • Buněčný cyklus AhR (PAH) • Induktory • PAHy • Dioxiny • Flavony, indoly • Kofein • Benzimidazoly (omeprazol) • Bilirubin, prostaglandiny AhR (PAH) • Ligandy • PAH, polychlorované bifenyly, polychlorované dibenzo-p-dioxiny • Metabolity sek. mtb rostlin (flavony) • Endogenní (deriváty tryptofanu, kys. arachidonové, bilirubin,…) AhR (PAH) • AhR • Není to jaderný receptor • PAS protein (Per-Arnt-Sim) – stará skupina • Regulace odpovědi na rychlé změny okolí • HIF-1α (faktor indukovaný hypoxií) AhR (PAH) • 3 domény • bHLH • Basic helix-loop-helix • Vazba na DNA • PAS • Vazba ligand AhR • TAD • Transaktivační doména • Glutaminové rezidua (transkripce) AhR (PAH) • Transkripční faktor • Aktivovaný specifickými ligandy • Reguluje expresi cílových genů AhR (PAH) • Inaktivní – cytoplazma • Komplex proteinů Hsp90, XAP2 a p23 • Po vazbě ligandu na inaktivní komplex dojde ke změně konformace • AhR+ligand jde do jádra • Spojí se s ARNT (AhR nuclear translocator) • Vazba na cílové regulační oblasti genů • Aktivace transkripce AhR (PAH) • Cílová sekvence – xenobiotické responzivní elementy (XRE/DRE) • ARNT se neváže jen na Ahr, ale i na HIF-1α AhR (PAH) • Regulace rodiny CYP1* • CYP 1A1, 1A2, 1B1 • 1A1 – exprese – biomarker kontaminace životního prostředí AhR ligandy AhR (PAH) • Produkty – aktivní elektrofilní sloučeniny • Benzo[a]pyren • Ligand AhR • Mtb CYP1 → stabilní adukt na DNA • Mutagen, karcinogen • Cigaretový kouř, ovzduší • Dlouhodobá aktivace AhR → dioxinová toxicita AhR (PAH) • Produkty – aktivní elektrofilní sloučeniny • Benzo[a]pyren • Ligand AhR • Mtb CYP1 → stabilní adukt na DNA • Mutagen, karcinogen • Cigaretový kouř, ovzduší • Dlouhodobá aktivace AhR → dioxinová toxicita Nukleární receptory • PXR, CAR, GR • Transkripce je regulována • Transkripčními faktory a nukl. receptory • Epigenetická regulace • Stabilizace/degradace mRNA • Degradace proteinu proteasomem Nukleární receptory • Aktivují transkripční kaskádu spouštějící expresi cílových genů v jádře • Ligandem je často xenobiotikum • Up-regulace • Fylogenetická ochrana Nukleární receptory • PXR a CAR • Aktivace nízkomolekulárními slouč., léčivy, endogenními steroidy • Senzory endo i exogenních toxických látek • Regulace CYP450 3A4 • Orphan – neznáme fyziol. ligand Nukleární receptory • Ligand+Rc – vazba v promotorové části cílového genu • Transkripční aktivace (mRNA) • Uvolnění korepresorů • Navázání koaktivátorů • Rozvolnění histony-DNA Nukleární receptory • Lokalizace • Játra, tenké a tlusté střevo, ledviny, plíce PB • Indukce phenobarbitalem • Zvýšení transkripce mRNA • Indukce nižší než u PAH • Aktivace transkripce bez vazby na nukleární receptor PB • Regulace • CYP 2B, epoxidhydrolasa, NADPH- cyt.P450-redukbsa • GST, UGT, sulfotransferasa • P-glykoprotein, MRP2, OATP2 • Induktory: • Barbituráty, chlorpromazin, clotrimazol, PCB, pesticidy Indukce steroidy a makrolidy • Indukce transkripce m-RNA i posttranskripčních změn • Zvýšená stabilita mRNA i enzymu Indukce steroidy a makrolidy • Induktory • Rifampicin, dexamethason, phenobarlrital • Některé steroidní hormony • Syntetické i endogenní glukokortikoidy • Makrolidová antibiotika • Regulace: • CYP 3A1 (u potkana), CYP 3A4 (u člověka), CYP 2C • Sulfotranzferáza (alkohol a žluč. kyseliny) • GST • P-glykoprotein, MRP2, OATP2 Indukce etanolem • Dlouhodobé podávání etanolu (zvýšení mtb) • Jednorázově (komp. inhibice) • CYP 2E1 • Zvýšení aktivity 2E1 • Exprese genu není ovlivněna • Stabilizace mRNA (diabetes) • Stabilizace bilkovinné molekuly posttranslační modifikace Indukce klofibrátem • CYP 4A* • Vazba na PPAR • Vazba na PXR receptor (tvorba dimeru) • Aktivace transkripce Indukce redukčních enzymů • Aldo/keto reduktázy • Induktory jsou jiné látky než CYP (doxorubicin,…) • Vazba na ARE (antioxidant responsive elements) • Rezistence, kardiotoxicita Shrnutí indukce • 3 mechanismy • Aktivace transkripce (většina) • Stabilizace mRNA (1A1, 1A2, 2B1, 2B2, 2E1, 3A*) • Stabilizace proteinů (2E1, 3A*) Shrnutí indukce • Výsledky • Zrychlení metabolismu • Snížení účinku • Tkáňová toxicita Tkáňová toxicita • Paracetamol • Běžné dávky • Glukuronidace, sulfatace (95 %) • Konjugace s glutationem (5 %) • Vysoké dávky • Glukuronidace, sulfatace – saturace • Dostatek GSH – malá hepatotoxicita • Aktivace CYP 1A2 (acetylbenzosemichinon) • Výsledek: • Nižší účinek, vyšší toxicita (biotransformace) Děkuji za pozornost