Polymerázová řetězová reakce
Základní technika molekulární diagnostiky.
CeneProof
Molecular diagnostics for your routine J
Kdo za to může?
LKary Mullis 1983
INobelova cena 1993
Princip PCR
Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v
podmínkách in vitro
o to procesem, který připomíná replikaci
DNA in vivo
Princip PCR - Zásadní předpoklady správné polymerace -
• Přítomnost tem plátu: polymerace je možná pouze podle známe matrice-templátu
• Přítomnost primerů: nelze začít od nuly
• Komplementarita: k polymeraci nukleotidů dochází vždy podle komplementární dvojice primer/templát
• Směr polymerace: připojování nukleotidů je vždy ve směru 5'-3'
Primer
Je řetězec nukleové kyseliny, který se skládá ze 18 až 25 nukleotidů (oligonukleotid)
Tm (melting teplota) alespoň 50°C
Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C
i v    i       t 3' 5'
ZOOpOVGQnG Z3 tgacctgaaaagac <—Primer
SpGCifiCnOSt PCR gatggactgattaccgatgactggacttttctg -4—Template
5' 3'
obsah   G+C   od 3< 5<
tgacctgaaaagac
gat ggactgatt accgat gact ggact t tt ctg 5' 3'
Princip PCR Zásadní předpoklady správné polymerace -
D= p-O-CH,
I
0"
0 H
1
0 = p-O-CH,
I
5'   °" H
o
H H,
OH H
DNA primer
I I I I I
nově syntetizovaný řetězec
.....
3
— 5
DNA matrice
Princip PCR
- Cyklické změny teplot reakční směsi -
Denaturace
Annealing Extenze
Princip PCR
- komponenty in vitro reakce -
Thermus aquatlcus, Thermococcus, Thermophllus, Pyrococcus
pufr MgO^) [číp
.............................. ssDNA
Denaturace 92-96°C
Průběh polymerace
-1. PCR cyklus -
1. denaturace (92-96°C)
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i
..............................
dsDNA
2. annealing (45-72°C)
primární produkty
3. extenze (72°C)
Průběh polymerace
- 2. PCR cyklus -
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
sekundární produkty
..............................
Průběh polymerace
- 3. PCR cyklus -
Průběh polymerace
- Další cykly -
Počet amplikonů vzrůstá geometricky
Technické provedení PCR - termocyklery -
Mikroprocesorem kontrolované zařízení, které obsahuje kovové reakční bloky vyhřívané a chlazené polovodiči, vodou, vzduchem nebo mikrovlnami
Termocyklery dokáží automaticky rychle měnit teplotu v reakčních blocích mezi třemi základními teplotám PCR cyklu
Systém kontrol PCR
• Izolační negativní kontrola
• Interní kontrola
• Negativní kontrola PCR
• Pozitivní kontrola PCR
Výsledek PCR
Elektroforéza
• V molekulární biologii se používá k separaci nukleových kyselin a bílkovin
• Principem je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli
• Gelová, polyakrylamidová
dráhy
Obr. Schéma elektroforetickej separácie (vľavo) a gél pod UV svetlom (vpravo)
Varianty PCR v praxi
PCR-RFLP nested PCR multiplex PCR kompetitivni PCR RT-PCR real-time PCR
PCR-RFLP
• Stanovení polymorfismu délky restrikčních fragmentů
• Amplifikace pomocí PCR a následné štěpení reštrikční endonukleázou
• Analýza elektroforézou
• Př. analýza prokaryotických genů pro 16S rRNA
PCR-RFLP
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i ..............................
amplifikace
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l
/J\
reštrikční štěpení
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
............. ......... .........
.........
Nested PCR
• Odstupňovaná PCR neboli PCR využívající vnějších a vnitřních primerů
• Amplifikace ve dvou krocích:
1) Amplifikace jedním párem vnějších primerů
2) Amplifikace vnitřními primery
• elektroforéza
One tube nested PCR
Ta = 653C
Ta = 653C
Ta = 583C
20 cyklů PCR Ta = 622C
30 cyklů PCR Ta = 522C
citlivost specifičnost
RT-PCR
• Reverzně transkripční PCR
• Určená pro amplifikaci molekul RNA
• Izolovaná RNA je převedená do cDNA
• Retrovirová zpětná transkriptáza
Reverzně transkripční PCR
Real-time PCR
• Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase
• Umožňuje kvantifikaci produktů v průběhu celé reakce
• Kvantifikace je důležitá při diagnostice některých patogenů (HBV, HCV, CMV, VZV, BK, JC, EBV, HSV)
• Není nutná elektroforéza
Princip real-time PCR
Detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu
Real-time PCR cyclery umožňují nejen střídání teplot, ale také čtení fluorescenčního signálu
Amplification Curves
6.9
8.1-
6*
I
i 4.1
I
E 3.3
V-os o.i
12 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920212223242526272829303132333435363738394041424344454647484950
3 metody kvantitativní detekce
• Pomocí interkalačního barviva vázajícího se na DNA
• Pomocí fluorescenčně značených primerů
• Pomocí fluorescenčně značených sond,
vázajících se na střední část amplikonu
SYBR Green
Fluorescenční kyninové barvivo, které fluoreskuje po vazbě na menší žlábek DNA
Fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím počtem amplikonů
Nemožnost odlišení nespecifických produktů
TaqMan sondy
• Jsou oligonukleotidy delší než primery, s hodnotou Tm o 10°C vyšší než primery, opatřené na 5' konci fluoroforem a na 3' konci zhášečem
• Fluorofory-heterocyklické polyaromatické uhlovodíky
• Zhášeče-molekuly, které jsou schopny absorbovat energii z excitovaného fluoroforu
- TTC ATG CTT GGA CCG AGT CTG ATT CCT -
5
3
Lineární sondy Hydrolysis (TaqMan®) Probes -
111111111111111111111111111111
I I I I I
o
..............................
LUX technologie
Využívá 2 primery, z nichž jeden z nich je fluorescenčně značený
Zhášení primeru je zajištěno sekundární strukturou vlásenky
K emisi fluorescence dojde po prodloužení
primeru
•
Primer Conformation
Postup kvantifikace pomocí Real Time PCR
s využitím TaqMan sondy
1. Stanovení Ct (Treshold cyklus)
2. Vytvoření kalibrační křivky
3. Kvantifikace neznámého vzorku pomocí vložené kalibrační řady
Stanovení Ct - Treshold cyclus -
• Ct - číselná hodnota udávající PCR cyklus ve kterém je přístrojem detekována první změna fluorescence v amplifikovaném vzorku
• Číselnou hodnotu Ct určuje přístroj automaticky
Vzorek -Ct
2   8   14 20 26 32 38 44 50
Počet PCR cyklů
Vytvoření kalibrační křivky
Kvantifikace neznámého vzorku pomocí
vložené kalibrační řady
38 ■
36
34
= 32-o
& 30 o 28 ■ 2 26 24 ■ 22 ■ 20 ■
Standard 10exp4 Standard 10exp3 Standard 10exp2 Standard 10expl Vzorek 1 Vzorek 2
0 i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i—i 6     10    14    18    22    26    30    34    38    42    46 50
Počet PCR cyklů
Vzorek	Typ vzorku	Ct	Koncentrace (kopií/ul)
1	Neznámý	25,64	3,50E+03
2	Neznámý	29,23	2,50E+02
K1	Standard	23,97	1.00E+04
K3	Standard	27,16	1.00E+03
K3	Standard	30,68	1.00E+02
K4	Standard	33,53	1.00E+01
lOexpl
10exp2 10exp3 Koncentrace
10exp4
Praktické příklady
Virus hepatitídy typu C
• Obalený+ssRNA virus
• Obsahuje jediný gen kódující polyprotein
• Vysoká heterogenita
• Onemocnění-hepatitída, hepatocelulární karcinom, jaterní cirhóza
• Léčba - interferon alfa, ribavirin
Diagnostika HCV
• Založena na průkazu protilátek anti-HCV metodou ELISA
• Průkaz RNA metodou reverzně transkripční PCR (kvalitativně-genotypizace a kvantitativně)
Obr. US: Algoritmus-: Testování pmtiMtek unii HCVnebfj combo textem antigen HCV/pfioňUStků EIA.
TESTOVÁNÍ PROTILÁTEK Anti HCV oebo kombfnoce HCV cmiiejen/protilálkc EIA
Výsledek:
Nebyly detekovaný protilátky HCV
nebo Nebyl detekován iiniisen/prutiiurk;* HCV
Z původního vzorku provedeme HCV PCR nebo detekci HCV antigenu
Vfsledík:
V souladu s akutní infekcí HCV. K potvrzeni prosím zopakujte test. V případe potvrzení výsledku doporuíujtEjne konzultaci se specialitou z důvodu daliiho hodnoceni léčby. Zvažte genOlypi/aci HCV. V připadá potřeby se ujiMew, jaký jc imunitní stav prii hcpatititdu A u B a zda nebylo provedeno očkovaní.
Výsledek: Nebyla proklaná akutní infekce HCV-Následují dalií test na pnxi látky.
PTEZJtouSejtE detekci piuiilaiek hcv jiným testem ťmipf. EIA o stejné f ithvesti jako první test. nebo immunobloieroj.
Výsledek:
Detekovaný protilátky HCV*4, Pro potměni pivívcrfte c-u
nejdříve noví míření hodnot protilátek a daHí vzorek teslujte
pomoci pcr za 6-12 měsíců.
Výsledek;
Neurčitý stav HCV proti Prosím zašlete >ině sérum
ilatck-
r
Výsledek; ,   V případe potřeby provedte (doplňující referenční tcsiovint
Diferenciální diagnostika v klinické mikrobiologii (Josef
Scharfen, ml.)
HCV PCR
• Klinický materiál - plazma, sérum
• Kvalitativní stanovení HCV - genotypizace je přínosná pro optimalizaci terapie, její délky a při odhadu účinnosti léčby
• Kvantitativní stanovení-u pacientů s antivirovou léčbou
• cíl detekce: konzervativní úsek 5'UTR sekvence
Kvantitativní stanovení HCV
ODPOVĚĎ V PRŮBĚHU TERAPIE
• rychlá virologická odpověď (RVR) - HCV RNA < 50
IU/ml ve 4. týdnu terapie
• parciální časná virologická odpověď (pEVR) - HCV
RNA ve 4. i 12. týdnu terapie je >50 IU/ml, avšak s poklesem nejméně o 2 loglO oproti výchozí virémii
• kompletní časná virologická odpověď (cEVR) - HCV
RNA ve 4. týdnu > 50 IU/ml, ve 12. týdnu negativní
• rezistence na léčbu (non response, NR) - hladina HCV RNA se sníží ve 12. týdnu o méně než 2 loglO oproti výchozí hodnotě
Odpověď na léčbu HCV
Graf 1. Hodnocení úspěšnosti léčby chronické VHC v průběhu a po ukončení terapie pegylovaným interferonem a ribavirinem
virémie (log10)
RVR - rychlá virologická odpověď cEVR - časná kompletní virologická odpověď pEVR - časná parciální virologická odpověď BT- breakthrough, fenomén průlomu Relaps
N R - nulová rezistence na léčbu EVR- časná virologická odpověď ETVR - virologická odpověď na konci léčby SVR - setrvalá virologická odpověď
0
3       12      16      20      24      36     48      60 72 týdennftera pie
Vitouš, A., Virová hepatitída typu C, diagnostika, terapie, prevence. Interní Med. 2010; 12(6): 339-342
Dotazy?
The search for ever more heat-stable DNA polymerases continues.